Решение Коллегии ЕЭК от 11.08.2020 № 100 "О Фармакопее Евразийского экономического союза"

В соответствии со статьями 30 и 56 Договора о Евразийском экономическом союзе от 29 мая 2014 года, пунктом 14 Протокола о применении санитарных, ветеринарно-санитарных и карантинных фитосанитарных мер (приложение N 12 к Договору о Евразийском экономическом союзе от 29 мая 2014 года), пунктом 3 статьи 5 Соглашения о единых принципах и правилах обращения лекарственных средств в рамках Евразийского экономического союза от 23 декабря 2014 года и Концепцией гармонизации фармакопей государств – членов Евразийского экономического союза, утвержденной Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22 сентября 2015 г. N 119, Коллегия Евразийской экономической комиссии РЕШИЛА:

1. Утвердить прилагаемую Фармакопею Евразийского экономического союза и ввести ее в действие с 1 марта 2021 г.

2. Установить, что до 1 января 2026 г. регистрационные досье лекарственных средств для медицинского применения и ветеринарных лекарственных средств должны быть приведены в соответствие с требованиями Фармакопеи Евразийского экономического союза, утвержденной настоящим Решением.

3. Настоящее Решение вступает в силу по истечении 180 календарных дней с даты его официального опубликования.

1.1. Общие положения

Положения раздела 1. Общие сведения распространяются на все тексты Фармакопеи Евразийского экономического союза.

Фармакопея Евразийского экономического союза представляет собой свод региональных требований и положений, устанавливающих предельный допустимый уровень качества лекарственных средств на фармацевтическом рынке Евразийского экономического союза. В текстах фармакопеи приводится сокращенное ее название - Фармакопея Союза. В ряде случаев может использоваться слово "фармакопея", которое подразумевает Фармакопею Союза.

Тексты Фармакопеи Союза включают общие сведения, общие разделы, фармакопейные статьи и приложения, которые публикуются на русском языке и являются официальными.

Фармакопейная статья (фармакопейная монография) представляет собой статью (монографию), устанавливающую требования и положения фармакопеи к лекарственным средствам, вспомогательным веществам и материалам, а также испытаниям и методам их проведения.

Фармакопейные статьи могут быть общими и частными.

Общая фармакопейная статья (общая фармакопейная монография) представляет собой фармакопейную статью (фармакопейную монографию), устанавливающую общие требования и положения к качеству и упаковке лекарственных средств, вспомогательных веществ и материалов, а также испытаниям, методам их проведения и используемым реактивам.

Частная фармакопейная статья (частная фармакопейная монография) представляет собой фармакопейную статью (фармакопейную монографию), устанавливающую специальные требования к качеству конкретных лекарственных средств, вспомогательных веществ и материалов.

Ссылка в материалах фармакопеи на фармакопейную статью и (или) ее раздел означает, что лекарственные средства, вспомогательные вещества и материалы соответствуют требованиям данной фармакопейной статьи. Название фармакопейной статьи, на которую приводится ссылка, и ее номер выделяются курсивом.

Требования фармакопеи на лекарственные препараты должны выполняться на всем протяжении их срока хранения. Фармакопейная статья не регламентирует срок хранения лекарственного препарата и (или) его спецификацию качества для вскрытой упаковки, которые должны быть согласованы с уполномоченным органом. Требования фармакопейных статей на любые другие материалы (активная фармацевтическая субстанция, вспомогательное вещество и др.), должны выполняться на всем протяжении их периода использования. Срок хранения и время, от которого отсчитывается срок хранения, должны быть согласованы с уполномоченным органом на основании экспериментальных результатов исследования стабильности.

Требования фармакопейных статей могут носить обязательный, рекомендательный и информационный характер. Требования частных фармакопейных статей являются обязательными при отсутствии других указаний, изложенных в 1. Общие сведения или общих фармакопейных статьях. Общие фармакопейные статьи становятся обязательными, если на них приводится ссылка в частной фармакопейной статье, за исключением случаев, когда ссылка имеет информационный или рекомендательный характер.

Активные фармацевтические субстанции, вспомогательные вещества, лекарственные препараты и другие материалы, описываемые в фармакопейных статьях, предназначены для применения как в медицине, так и ветеринарии, при отсутствии особого указания об использовании только в одной из данных областей.

Системы качества. Стандарты качества, установленные в фармакопейных статьях, применимы к рассматриваемым лекарственным средствам, вспомогательным веществам и материалам лишь при условии их производства в рамках соответствующей системы качества. Система качества должна обеспечивать постоянное соответствие лекарственных средств, вспомогательных веществ и материалов требованиям фармакопейных стандартов.

Альтернативные методики. Все испытания и методики, приведенные в фармакопее, являются официальными и составляют основу фармакопейных стандартов качества.

По согласованию с уполномоченным органом при контроле качества лекарственных средств могут использоваться альтернативные методики. Альтернативные методики, включаемые в спецификации качества производителя и (или) нормативные документы по качеству, должны обеспечивать возможность принятия такого же однозначного решения о соответствии лекарственного средства требованиям фармакопейной статьи, как и при использовании официальных методик. Альтернативность предложенных методик подтверждается путем проведения валидации по тем же валидационным характеристикам, что и в случае фармакопейных методик. Валидация аналитических методик должна проводиться в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи Валидация аналитических методик. В случае сомнений и разногласий основополагающими являются только фармакопейные методики анализа.

Подтверждение соответствия требованиям фармакопеи. (1) Лекарственное средство, вспомогательное вещество и материал считаются фармакопейного качества лишь при его соответствии всем требованиям частной фармакопейной статьи. Данное условие не означает необходимость выполнения производителем всех испытаний, описанных в частной фармакопейной статье, при оценке соответствия фармакопее до выпуска лекарственного препарата в обращение. Производитель может быть уверенным в фармакопейном качестве лекарственного средства на основании данных его разработки, сопровождаемых стратегией его контроля и данными, полученными, например, при валидации производственного процесса.

(2) Улучшенный подход к контролю качества может предусматривать использование процессно-аналитической технологии и/или стратегии испытаний при выпуске в режиме реального времени (включая выпуск по параметрам производственного процесса) как единственной альтернативы испытаниям готового продукта. Испытания при выпуске в режиме реального времени в условиях, признанных приемлемыми уполномоченным органом, не исключают, таким образом, необходимость соответствовать фармакопейным требованиям.

(3) Сокращение испытаний на животных: фармакопея предусматривает постепенный отказ от испытаний с использованием животных путем замены, сокращения, усовершенствования испытаний в соответствии с положениями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Для подтверждения соответствия требованиям фармакопеи, как показано выше (1), производители могут устанавливать дополнительные системы для контроля постоянства производства. По согласованию с уполномоченным органом выбор испытаний для оценки соответствия требованиям фармакопеи, включающих испытания на животных, осуществляется таким образом, чтобы минимизировать по возможности их использование.

Квалификация материалов. Некоторые материалы, требования к которым установлены в частных фармакопейных статьях, могут производиться с различным качеством в зависимости от их назначения. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье ее требования распространяются на все квалификации (категории, формы, марки, классы) материалов. В некоторых частных фармакопейных статьях, например, на вспомогательные вещества, в качестве дополнительной информации может быть приведен перечень функциональных характеристик вещества, важных для его использования. Кроме того, в частной фармакопейной статье для информации могут быть приведены методики определения одной или нескольких таких характеристик. Информационный или рекомендательный характер сведений на вспомогательные вещества указан в общей фармакопейной статье Функциональные характеристики вспомогательных веществ.

Валидация фармакопейных методик. Методики испытания, приведенные в общих и частных фармакопейных статьях, валидированы в соответствии с общепринятой научной практикой и современными рекомендациями по валидации аналитических методик. При отсутствии других указаний в общей и частной фармакопейных статьях проведение валидации аналитической методики не требуется.

Выполнение фармакопейных методик. При выполнении фармакопейных методик исполнитель должен оценить (верифицировать), подходит ли методика в реальных условиях использования и в какой степени подходит для подтверждения соответствия требованиям частных и общих фармакопейных статей, а также систем качества. Оценка пригодности фармакопейной методики и степени ее пригодности должна проводиться в соответствии с требованиями общей фармакопейной статьи Верификация фармакопейных методик.

Принятая терминология. Термин "уполномоченный орган (организация)" означает орган (организацию), наделенный(ую) правом принятия решений по вопросам обращения лекарственных средств.

Выражение "при отсутствии другого обоснования и разрешения уполномоченного органа" означает, что требования фармакопейной статьи должны быть выполнены, если только по разрешению уполномоченного органа в эти требования не внесены изменения или исключения, обоснованные для определенного случая,

В некоторых фармакопейных статьях или других текстах при описании реактива, микроорганизма, методики испытания и т.д. используется термин "подходящий" или "пригодный". Если при этом критерии их пригодности не описаны в фармакопейной статье, пригодность должна быть подтверждена перед уполномоченным органом.

В фармакопее используют следующие ключевые термины и их определения.

Лекарственное средство - средство, представляющее собой или содержащее вещество или комбинацию веществ, вступающее в контакт с организмом человека, предназначенное для лечения, профилактики заболеваний человека или восстановления, коррекции или изменения его физиологических функций посредством фармакологического, иммунологического или метаболического воздействия или для диагностики заболеваний и состояний человека.

Лекарственный препарат - лекарственное средство в виде лекарственной формы.

Лекарственная форма - состояние лекарственного препарата, соответствующее способам его введения и применения и обеспечивающее достижение необходимого эффекта.

Субстанция для фармацевтического применения - субстанция, предназначенная для производства и изготовления лекарственных препаратов.

Активная фармацевтическая субстанция (фармацевтическая субстанция) - субстанция для фармацевтического применения, содержащая действующее(ие) вещество(а) химического, растительного, животного и человеческого происхождения.

Вспомогательное вещество - субстанция для фармацевтического применения, не являющаяся активной фармацевтической субстанцией для данного лекарственного препарата и предназначенная для создания лекарственной формы с определенными свойствами.

Ссылки на регуляторные документы. Общие и частные фармакопейные статьи могут содержать ссылки на нормативные правовые акты Союза. Данные ссылки представлены пользователям фармакопеи для информации. Включение такой ссылки не изменяет статус указанного документа, который может быть обязательным или рекомендательным.

1.2. Иные положения, распространяющиеся на общие и частные фармакопейные статьи

Количество вещества. В испытаниях с численно заданными пределами или в методиках количественного определения указывается приблизительное количество испытуемой пробы. Количество вещества, которое может отклоняться в пределах не более 10% от указанного в фармакопейной статье количества, точно взвешивают или отмеряют, и все вычисления производят с использованием полученного точного количества. Если пределы в испытании не заданы численно, а определяются путем сравнения со стандартным образцом при тех же условиях, в испытаниях используют строго указанное в фармакопейной статье количество анализируемой пробы, Реактивы всегда применяют в указанных количествах.

Количество вещества взвешивают или отмеряют в соответствии с указанной степенью точности. Точность взвешивания должна составлять +/- 5 единиц после последней указанной в фармакопейной статье цифры (например, навеска 0,25 г должна быть взята в пределах от 0,245 г до 0,255 г). Объемы отмеривают следующим образом. Если после десятичной запятой стоит 0 или число, заканчивающееся 0 (например, 10,0 мл или 0,50 мл), требуемый объем отмеряют с помощью пипетки, мерной колбы или бюретки. В остальных случаях можно использовать градуированный мерный цилиндр или градуированную пипетку, Объем жидкости, выраженный в микролитрах, отмеряют с помощью микропипетки или микрошприца.

Однако в некоторых случаях точность, с которой указывают количество вещества, может не соответствовать числу значащих цифр, указанных в заданных количественных пределах. Взвешивание и измерение в данных случаях должны проводиться с более высокой точностью.

Оборудование и аналитические операции. Мерная посуда должна отвечать требованиям класса A соответствующего стандарта Международной организации по стандартизации (ISO). Допускается использование мерной посуды класса точности 1 соответствующего стандарта государства - члена Союза при условии подтверждения, что замена мерной посуды класса A на мерную посуду класса 1 не увеличивает значение расширенной неопределенности результата испытания.

Аналитические операции, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, проводят при температуре от 15 °C до 25 °C.

Сравнительные испытания, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, выполняют с использованием идентичных пробирок из бесцветного прозрачного нейтрального стекла с плоским основанием и внутренним диаметром 16 мм, так как указываемые объемы жидкостей рассчитаны для данного диаметра; пробирки с большим внутренним диаметром могут применяться при условии корректирования объема используемой жидкости (общая фармакопейная статья 2.1.1.5). Сравнение равных объемов жидкостей выполняют по направлению вниз вдоль вертикальной оси пробирок на белом или, при необходимости, черном фоне. Испытание проводят в рассеянном свете.

Если для проведения испытания или количественного определения требуется использовать растворитель с растворенным в нем индикатором и при этом не предусмотрен контрольный опыт, растворитель предварительно нейтрализуют по данному индикатору.

Водяная баня. Термин "водяная баня" означает баню с кипящей водой, при отсутствии указаний в частной фармакопейной статье другой температуры воды.

Допускается использование других способов нагревания, если обеспечивается температура, близкая, но не выше 100 °C или другой указанной температуры.

Высушивание и прокаливание до постоянной массы. Термины "высушивание до постоянной массы" или "прокаливание до постоянной массы" означают, что результаты двух последовательных взвешиваний не должны отличаться более чем на 0,5 мг; продолжительность дополнительного высушивания или прокаливания перед вторым взвешиванием определяется свойствами и количеством высушиваемого или прокаливаемого остатка.

В тех случаях, когда требуется высушивание в эксикаторе или в вакууме, высушивание осуществляется в соответствии с условиями, описанными в общей фармакопейной статье. Потеря в массе при высушивании.

Реактивы. Надлежащее выполнение аналитических операций, описанных в фармакопее, и достоверность получаемых результатов зависит, в частности, от качества используемых реактивов. Спецификации на реактивы приведены в общих фармакопейных статьях раздела Реактивы. При проведении испытаний предполагается использование реактивов квалификации "аналитическая степень чистоты" для некоторых реактивов в спецификации включают испытания для определения пригодности.

Растворители. Если в фармакопейной статье не указывается название растворителя, термин "раствор" означает водный раствор.

Термин "вода" означает воду очищенную. Для проведения описанных в фармакопее аналитических операций или приготовления реактивов используют воду, соответствующую требованиям частной фармакопейной статьи Вода очищенная, за исключением требований к содержанию бактериальных эндотоксинов (Воды очищенной нерасфасованный продукт) и микробиологической чистоты (Вода очищенная в упаковке). Термин "вода дистиллированная" означает воду очищенную, полученную методом дистилляции.

Термин "этанол" без указания квалификации означает этанол безводный. Термин "спирт" без указания квалификации означает 96% (об/об) этанол. Другие степени разбавления обозначают термином "этанол" или "спирт" с указанием содержания этанола (C2H6O) в объемных процентах.

Способы выражения содержания. При определении содержания выражение "процент" используется в зависимости от условий в одном из трех значений:

- массовый процент (м/м), выражающий количество граммов вещества в 100 граммах готового продукта;

- объемный процент (об/об), выражающий количество миллилитров вещества в 100 миллилитрах готового продукта;

- массо-объемный процент (м/об), выражающий количество граммов вещества в 100 миллилитрах готового продукта.

Обозначение миллионной доли или части на миллион (или ppm) и миллиардной доли или части на миллиард (или ppb) подразумевает массовое соотношение, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Количества жидких веществ и растворов, применяемых при приготовлении смесей, могут указываться в виде соотношения по объему (об/об).

Температура. Если в аналитических методиках не указаны значения температуры, используют следующие общие термины:

1.3. Общие разделы (главы) и общие фармакопейные статьи

Названия общих разделов (глав) и общих фармакопейных статей приводят на русском языке. В ряде случаев (например, в общих фармакопейных статьях на лекарственные формы) допускается дополнительное указание названий на латинском языке.

Общие разделы (главы). Общие разделы (главы) фармакопеи могут включать несколько общих фармакопейных статей, объединенных по типам объектов фармакопейной стандартизации, видам испытаний и методам их проведения, характеру требований и т.д. Например, общие разделы (главы) могут содержать общие фармакопейные статьи на физические и физико-химические методы испытаний, биологические методы испытаний, упаковку и материалы упаковки, реактивы и др.

Общие фармакопейные статьи. Субстанции для фармацевтического применения, лекарственные препараты и другие материалы, описанные в частных фармакопейных статьях, должны также отвечать требованиям соответствующей общей фармакопейной статьи.

Общие фармакопейные статьи распространяются на все субстанции для фармацевтического применения и лекарственные препараты согласно области применения данных общих статей, за исключением случаев, когда это применение ограничивается указаниями в частных фармакопейных статьях или вводной части общей фармакопейной статьи, например, только для субстанций для фармацевтического применения и лекарственных препаратов, описанных в частной фармакопейной статье.

Общая фармакопейная статья на ту или иную лекарственную форму распространяется на все лекарственные препараты, произведенные в данной лекарственной форме. Для конкретного лекарственного препарата требования соответствующей общей фармакопейной статьи необязательно являются исчерпывающими и могут быть дополнены по согласованию с уполномоченным органом.

Общие и частные фармакопейные статьи взаимно дополняют друг друга. Если требования общей фармакопейной статьи не применимы к определенному лекарственному препарату, об этом указывают в частной фармакопейной статье.

Упаковка. Материалы, применяемые для упаковки, описаны в общем разделе Фармакопеи Союза. Для материалов, используемых для производства упаковки, особенно полимерных материалов, применяют общие названия, каждое из которых охватывает ряд материалов, отличающихся как свойствами основного компонента, так и используемыми добавками. Методики испытаний и допустимые пределы показателей качества зависят от конкретного состава материала и, таким образом, применимы только к материалам, состав которых соответствует вводной части его спецификации. Использование материалов с другим составом, методик испытаний и допустимых пределов показателей их качества должно быть согласовано с уполномоченным органом.

Спецификации на упаковку, включенные в общий раздел Фармакопеи Союза, разработаны для упаковок всех указанных категорий. Однако, учитывая большое разнообразие существующих упаковок и вероятность появления новых упаковок, не исключается возможность использования упаковок, соответствующих другим спецификациям, при согласовании с уполномоченным органом.

В фармакопейных статьях могут быть приведены ссылки на определения и спецификации упаковок, содержащиеся в разделе Упаковка. В разделах Определение и Производство общих фармакопейных статей на лекарственные формы может содержаться требование по использованию определенного типа упаковки. В разделе Хранение некоторых фармакопейных статей может указываться тип рекомендуемой упаковки.

1.4. Частные фармакопейные статьи

Частная фармакопейная статья может включать следующие разделы.

НАЗВАНИЯ

Названия частных фармакопейных статей приводят на русском языке, а также латинском и английском языках.

В названиях частных фармакопейных статей на субстанции для фармацевтического применения указывают международное непатентованное название (МНН), а при его отсутствии - общепринятое название действующего вещества. При необходимости оно дополняется названием аниона или катиона и степенью гидратации.

В названиях частных фармакопейных статей на лекарственные препараты дополнительно указывают вид лекарственной формы.

ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ АТОМНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАССЫ

Относительные атомные массы и относительные молекулярные массы указывают в частных фармакопейных статьях на субстанции для фармацевтического применения.

Относительная атомная масса (Ar) или относительная молекулярная масса (Mr) указывается, в случае приемлемости, в начале частной фармакопейной статьи. Относительную атомную и относительную молекулярную массы, молекулярную и графическую формулы приводят в информационных целях.

РЕГИСТРАЦИОННЫЕ НОМЕРА ХИМИЧЕСКОЙ РЕФЕРАТИВНОЙ СЛУЖБЫ

Регистрационные номера Химической реферативной службы (CAS) включаются, в случае применимости, в частные фармакопейные статьи на субстанции для фармацевтического применения для информации с целью предоставления пользователям удобного к ней доступа. Регистрационные номера CAS являются зарегистрированной торговой маркой Американского химического общества.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Положения, указанные в разделе Определение частной фармакопейной статьи, представляют собой официальное определение субстанции для фармацевтического применения, лекарственного препарата или другого материала, являющегося предметом частной фармакопейной статьи.

Пределы содержания. Пределы содержания, указанные в частной фармакопейной статье, означают пределы, полученные с использованием методики, приведенной в разделе Количественное определение.

Лекарственное растительное сырье. В частных фармакопейных статьях на лекарственное растительное сырье в разделе Определение указывается предмет статьи, например, цельное сырье или сырье, измельченное в порошок. Если частная фармакопейная статья распространяется на лекарственное растительное сырье в нескольких состояниях, например, цельное или измельченное в порошок сырье, то это указывается в определении.

ПРОИЗВОДСТВО

Положения, приведенные в разделе Производство частной фармакопейной статьи, предназначены для выделения некоторых важных аспектов процесса производства и необязательно являются исчерпывающими. В разделе содержатся обязательные требования к производителю при отсутствии других указаний. Они могут относиться, например, к исходным материалам, технологическому процессу, его валидации и контролю, внутрипроизводственному контролю, а также к испытаниям, которые производитель должен проводить перед выпуском на каждой серии или выбранных сериях готового продукта. Данные требования необязательно могут быть подтверждены при независимом контроле образцов готового продукта. Уполномоченным органом может быть установлено выполнение требований, например, путем проверки полученных от производителя данных, или при инспектировании производства, или испытании соответствующих образцов.

Отсутствие в частной фармакопейной статье раздела Производство не означает, что требования к процессам производства, например, указанные выше, не должны выполняться.

Выбор вакцинного штамма. Выбор состава вакцины. В разделе Производство частной фармакопейной статьи на вакцину могут быть указаны характеристики вакцинного штамма или ее состав. При отсутствии других указаний методики испытаний, описываемые в разделе для подтверждения данных характеристик, приводятся для информации в качестве примера подходящих методик. По разрешению уполномоченного органа без проведения валидации могут использоваться другие методики испытаний при условии их сравнения с методиками, описанными в частной фармакопейной статье.

ВОЗМОЖНАЯ ФАЛЬСИФИКАЦИЯ

В связи с увеличением количества случаев фальсификации лекарственных средств и активизации подобной деятельности для пользователей фармакопеи должна быть доступной любая информация с целью содействия обнаружению фальсифицированных материалов (т.е. активных фармацевтических субстанций, вспомогательных веществ, промежуточной продукции, нерасфасованной продукции и готовой продукции).

С этой целью методика обнаружения возможных фальсификатов и соответствующие пределы содержания вместе с указанием, что все стадии производства и поставки сырья и материалов являются предметом соответствующих систем качества, могут включаться в данный раздел частных фармакопейных статей на субстанции для фармацевтического применения, для которых имел место или присутствует риск преднамеренной контаминации. Частота испытаний, проводимых производителями или пользователями (например, производителями промежуточной продукции, нерасфасованной продукции и готовой продукции, соответственно), зависит от оценки рисков, учитывающей уровень сведений о полной цепи поставок и региональных требованиях.

Данный раздел устанавливает требования для полной цепи поставок от производителей до пользователей (например, производителей промежуточной продукции, нерасфасованной продукции и готовой продукции, соответственно). Отсутствие в частной фармакопейной статье данного раздела не означает, что требования, например, указанные выше, не должны выполняться.

СВОЙСТВА

Раздел Свойства приводится в частных фармакопейных статьях на субстанции для фармацевтического применения.

Сведения, приведенные в данном разделе частной фармакопейной статьи, как правило, могут не рассматриваться в качестве обязательных указаний и носят информационный характер.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Раздел Идентификация приводится в частных фармакопейных статьях как на субстанции для фармацевтического применения, так и лекарственные препараты.

Область применения. Испытания, приведенные в данном разделе частной фармакопейной статьи, не обеспечивают полное подтверждение химической структуры или состава лекарственного средства или вспомогательного материала. Они предназначены для подтверждения с приемлемой степенью достоверности того, что лекарственное средство, вспомогательное вещество или материал соответствует информации, приведенной на этикетке.

Первая и вторая идентификация. В некоторых частных фармакопейных статьях имеются подразделы Первая идентификация и Вторая идентификация. Во всех случаях может(гут) применяться испытание(я), приведенное(ые) в подразделе Первая идентификация. Испытание(я), включенное(ые) в подраздел Вторая идентификация, может(гут) использоваться в аптеках при наличии доказательства полной принадлежности субстанции для фармацевтического применения или лекарственного препарата серии, сертифицированной на соответствие всем другим требованиям частной фармакопейной статьи.

Некоторые частные фармакопейные статьи содержат два и несколько испытаний, предназначенных для первой идентификации, которые являются взаимозаменяемыми и могут применяться независимо друг от друга. Как правило, одно или несколько таких испытаний включают перекрестную ссылку на испытание, указанное в разделе Испытания частной фармакопейной статьи. Это может использоваться для упрощения работы аналитика, выполняющего идентификацию и указанные испытания. Например, в одном испытании на подлинность имеется ссылка на испытание энантиомерной чистоты, в то время как другое представляет собой определение удельного оптического вращения, при этом цель обоих испытаний одинакова: подтвердить присутствие соответствующего энантиомера.

Лекарственное растительное сырье, измельченное в порошок. Частные фармакопейные статьи на лекарственное растительное сырье могут содержать схематическое изображение (рисунки, микрофотографии) диагностических анатомических признаков лекарственного растительного сырья, измельченного в порошок. Такие иллюстрации дополняют описание, приведенное в соответствующем испытании на подлинность.

ИСПЫТАНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Разделы Испытания и Количественное определение приводятся в частных фармакопейных статьях как на субстанции для фармацевтического применения, так и лекарственные препараты.

Область применения. Содержащиеся в частной фармакопейной статье требования не рассчитаны на оценку всех возможных примесей. В частности, если примесь не определяется с помощью приведенных в частной фармакопейной статье испытаний, а практическая целесообразность и надлежащая фармацевтическая практика не допускают ее присутствия, не следует считать такую примесь допустимой (см. также ниже раздел Примеси).

Расчеты. Если для получения окончательного результата испытаний или количественного определения требуется выполнить пересчет на сухую или безводную субстанцию или на какое-либо другое условие, потерю в массе при высушивании, содержание воды или иной показатель определяют по методике испытания, описанной в частной фармакопейной статье. Если проводится количественное определение остаточных растворителей, но не проводится определение потери в массе при высушивании, содержание остаточных растворителей учитывают при расчете количественного содержания основного вещества, удельного оптического вращения и удельного показателя поглощения.

Пределы. Указанные в частной фармакопейной статье пределы основаны на результатах, полученных в рамках обычной аналитической практики, когда в них уже учтены погрешности аналитического эксперимента, допустимый разброс при производстве и изготовлении, а также ухудшение качества в приемлемой степени при хранении. При определении соответствия лекарственного средства, вспомогательного вещества и материала требованиям частной фармакопейной статьи к указанным пределам не должны добавляться никакие дополнительные допуски.

При установлении соответствия численному значению предела результаты, полученные при испытании или количественном определении, округляют до указанного в пределе числа значащих цифр, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Пределы, независимо от выражения их в процентах или абсолютных величинах, считают значимыми до последнего знака (например, в числе 140 имеется три значащих цифры). При этом последнюю цифру результата увеличивают на единицу, если цифра, отбрасываемая при округлении, больше или равна пяти; если цифра, отбрасываемая при округлении, меньше пяти, последнюю цифру оставляют неизменной.

Нормирование пределов содержания примесей. В частных фармакопейных статьях критерии приемлемости содержания родственных примесей выражают либо путем сравнения площадей пиков (сравнительные испытания), либо в виде численных значений. При сравнительных испытаниях примерное допустимое содержание примеси или суммы примесей может указываться в скобках лишь для информации. Решение о качестве материала или лекарственного препарата принимают на основе соответствия или несоответствия требованиям приведенного в частной фармакопейной статье испытания. Если для данной примеси не предусмотрено использование стандартного образца, ее содержание может быть выражено, исходя из номинальной концентрации вещества, используемого для приготовления указанного в частной фармакопейной статье раствора сравнения, при отсутствии других указаний.

Лекарственное растительное сырье. Для лекарственного растительного сырья сульфатную золу, общую золу, водорастворимые примеси, примеси, растворимые в спирте, содержание воды, содержание эфирных масел и содержание активных веществ вычисляют в расчете на лекарственное сырье, которое не было специально высушено при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Эквиваленты. Приведенные в частных фармакопейных статьях значения эквивалентов указаны с количеством значащих цифр, требуемых в данной фармакопейной статье.

Питательные среды. Выбор питательных сред, описанных в общих и частных фармакопейных статьях, основан на их предполагаемом применении. Однако компоненты среды, особенно биологического происхождения, могут иметь различное качество, в связи с чем для лучшего выполнения испытания может потребоваться изменение концентрации некоторых ингредиентов, в частности:

- пептонов, а также мясных или дрожжевых экстрактов с учетом их питательных свойств;

- буферных веществ;

- желчных солей, желчного экстракта, дезоксихолата, красящих веществ в зависимости от их селективных свойств;

- антибиотиков в зависимости от их активности.

ХРАНЕНИЕ

Информация и рекомендации, приведенные в разделе Хранение частной фармакопейной статьи, не являются обязательными, однако по согласованию с уполномоченным органом могут указываться конкретные условия хранения, обязательные для исполнения.

Описанные в фармакопее лекарственные средства, вспомогательные вещества и материалы хранят таким образом, чтобы предотвратить их загрязнение и, по возможности, ухудшение качества. Если рекомендуются особые условия хранения, включая тип упаковки (см. Общие разделы и общие фармакопейные статьи) и температурные пределы, они указываются в частной фармакопейной статье.

Ниже приводятся значения терминов, используемых в частных фармакопейных статьях в разделе Хранение.

Требование "В воздухонепроницаемой упаковке" означает, что лекарственные средства, вспомогательные вещества и материалы должны храниться в воздухонепроницаемой упаковке. При вскрытии упаковки во влажной атмосфере следует проявлять осторожность. При необходимости низкое содержание влаги можно поддерживать с помощью осушающих веществ при условии, что их прямой контакт с содержимым упаковки будет исключен.

Требование "В защищенном от света месте" означает одно из трех условий:

- лекарственное средство, вспомогательное вещество и материал должны храниться в упаковке, изготовленной из материала, который в достаточной степени поглощает актиничный свет;

- упаковка с лекарственным средством, вспомогательным веществом и материалом должна быть помещена во внешнюю упаковку, обеспечивающую защиту от действия актиничного света;

- лекарственное средство, вспомогательное вещество и материал должны храниться в месте, исключающем возможность попадания актиничного света.

МАРКИРОВКА

Требования фармакопеи к маркировке не являются всеобъемлющими, более того, для фармакопейных целей обязательными являются лишь те положения, которые необходимы для подтверждения соответствия или несоответствия лекарственного препарата требованиям частной фармакопейной статьи. Все другие положения носят рекомендательный характер. В тех случаях, когда в фармакопее используется термин "этикетка", по решению уполномоченного органа соответствующая информация может приводиться на упаковке, в инструкции по медицинскому применению, общей характеристике лекарственного препарата (листке-вкладыше) или сертификате анализа, сопровождающем лекарственное средство, вспомогательное вещество и материал.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ

Описываемые в фармакопее материалы и реактивы могут оказаться опасными для здоровья, если не предпринять необходимых мер предосторожности. Во всех случаях необходимо придерживаться принципов надлежащей лабораторной практики в контроле качества, а также соответствующих правил техники безопасности. В некоторые частные фармакопейные статьи включаются специальные указания о необходимых мерах предосторожности. Но отсутствие таких указаний не должно рассматриваться как отсутствие всякого риска.

ПРИМЕСИ

Раздел Примеси приводится в частных фармакопейных статьях на субстанции для фармацевтического применения.

В частной фармакопейной статье может быть приведен перечень всех известных и возможных примесей, которые могут быть обнаружены с помощью описанных в данной фармакопейной статье испытаний (см. также общую фармакопейную статью Контроль примесей в субстанциях для фармацевтического применения). Примеси обозначаются буквами латинского алфавита. Если буква отсутствует, это означает, что примесь, соответствующая этой букве, исключена из перечня примесей при разработке или пересмотре частной фармакопейной статьи.

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

В частные фармакопейные статьи на вспомогательные вещества может быть включен раздел, описывающий функциональные характеристики. Характеристики, методики испытаний для их определения и допустимые нормы отклонения, описанные в данном разделе, не являются обязательными требованиями. Тем не менее, они могут быть важны при использовании вспомогательных веществ и приводятся для информации (см. также 1.1. Общие положения).

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ

Некоторые частные фармакопейные статьи требуют использования стандартных образцов, к которым относятся стандартные образцы химических веществ, растительные стандартные образцы, стандартные образцы биологических препаратов, стандартные спектры (см. также общую фармакопейную статью Стандартные образцы).

В качестве стандартных образцов Фармакопеи Союза принимаются стандартные образцы фармакопей государств - членов Союза и основных фармакопей, с которыми гармонизирована Фармакопея Союза.

1.5. Сокращения и обозначения

СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В СТАТЬЯХ НА ИММУНОГЛОБУЛИНЫ, СЫВОРОТКИ И ВАКЦИНЫ

КОЛЛЕКЦИИ И ДЕПОЗИТАРИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ

РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

1.6. Единицы международной системы (СИ), используемые в Фармакопее СОЮЗА, и их соответствие другим единицам

МЕЖДУНАРОДНАЯ СИСТЕМА ЕДИНИЦ

Международная система единиц (СИ) включает три класса единиц: основные единицы, производные единицы и дополнительные единицы. Основные единицы и их определения приведены в таблице 1.6.-1.

Таблица 1.6.-1. - Основные единицы Международной системы единиц

Производные единицы могут быть образованы сочетанием основных единиц согласно алгебраическим соотношениям, связывающим соответствующие количества. Некоторые из таких производных единиц имеют свои названия и обозначения. Единицы СИ, используемые в Фармакопее Союза, приведены в таблице 1.6.-2.

Таблица 1.6.-2. - Единицы Международной системы единиц, используемые в Фармакопее Союза, и их соответствие другим единицам

Таблица 1.6.-2. - (окончание)

Некоторые важные и широко используемые единицы, не входящие в СИ, приведены в таблице 1.6.-3.

Таблица 1.6.-3. - Единицы, используемые наряду с единицами Международной системы единиц

Множители и приставки для образования десятичных кратных и дольных единиц приведены в таблице 1.6.-4.

Таблица 1.6.-4. - Множители и приставки для образования десятичных кратных и дольных единиц

ПРИМЕЧАНИЯ

1. В Фармакопее Союза температуру выражают по шкале Цельсия (обозначение t). Температуру по Цельсию определяют по уравнению:

где T0 = 273,15 K. Температуру по шкале Цельсия выражают в градусах Цельсия (обозначение °C). Один градус Цельсия равен одному кельвину.

2. Практические выражения для концентраций, используемых в фармакопее, определены в общем разделе 1. Общие сведения.

3. Радиан представляет собой угол на плоскости между двумя радиусами круга, отсекающими на окружности дугу, равную по длине радиусу.

4. В Фармакопее Союза условия центрифугирования определяют центробежным ускорением по отношению к ускорению свободного падения (g):

5. В Фармакопее Союза некоторые величины используют без указания единиц измерения, например, относительная плотность (2.1.2.5), поглощение (2.1.2.24), удельный показатель поглощения и показатель преломления (2.1.2.6).

6. Микрокатал представляет собой единицу ферментативной активности, которая при указанных условиях приводит к трансформации (например, к гидролизу) 1 микромоль субстрата в секунду.

2.1.1.1. Каплемеры

Термин "капли" обозначает капли, свободно вытекающие из стандартного каплемера (рисунок 2.1.1.1.-1). Стандартные каплемеры изготавливают из бесцветного стекла. Нижний конец имеет круглое отверстие, расположенное в плоскости, перпендикулярной оси.

Рисунок 2.1.1.1.-1. - Стандартный каплемер. Размеры приведены в миллиметрах

Другие каплемеры могут быть использованы, если они отвечают требованиям следующего теста.

Двадцать капель воды P при температуре 20 +/- 1 °C, свободно вытекающих из каплемера (пипетки), удерживаемого в вертикальном положении, со скоростью одна капля в секунду, должны иметь массу 1000 +/- 50 мг.

Каплемер перед использованием должен быть тщательно вымыт. Проводят три измерения для каждого каплемера. Ни один из результатов не должен отклоняться более чем на 5% от среднего значения трех измерений.

2.1.1.2. Пористость стеклянных фильтров

Области применения фильтров (диаметр в микрометрах), пределы которых являются приблизительными:

- <= 2,5 - бактериальная фильтрация;

Таблица 2.1.1.2.-1. - Пористость стеклянных фильтров

--------------------------------

<1> Система, предложенная Международной Организацией по Стандартизации (ISO) и одобренная Европейской Фармакопеей (Ph. Eur.).

- 4 - 10 - ультратонкая фильтрация, отделение микроорганизмов большого диаметра;

- 10 - 40 - аналитическая фильтрация, очень тонкая фильтрация ртути, очень тонкое диспергирование газов;

- 40 - 100 - тонкая фильтрация, фильтрация ртути, тонкое диспергирование газов;

- 100 - 160 - фильтрация крупнозернистых материалов, диспергирование и промывка газов, использование в качестве подложки для других фильтрующих материалов;

- 160 - 500 - фильтрация очень крупнозернистых материалов, диспергирование и промывка газов.

2.1.1.3. Лампы с ультрафиолетовым излучением для аналитических целей

В качестве источника ультрафиолетового излучения в кварцевых лампах используются пары ртути. Для устранения видимой части спектра, испускаемого лампой, может использоваться подходящий фильтр. Если Фармакопея предписывает использование ультрафиолетовой лампы 254 нм или 365 нм, используют прибор, состоящий из лампы, содержащей пары ртути и фильтра, дающего спектр излучения с максимальной интенсивностью около 254 нм или 365 нм. Используемая лампа должна позволять однозначно обнаруживать стандартное пятно натрия салицилата диаметром около 5 мм на пластинке со слоем силикагеля G P, причем пятно должно исследоваться в положении, перпендикулярном к излучению лампы.

Для этой цели используют 5 мкл раствора 0,4 г/л натрия салицилата P в 96% спирте P (спирт не должен флуоресцировать) для ламп с максимальным излучением 254 нм и 5 мкл раствора 2 г/л натрия салицилата P в 96% спирте P для ламп с максимальным излучением при 365 нм. Расстояние между лампой и хроматографической пластинкой, указанное в частной фармакопейной статье, не должно превышать расстояния при проведении вышеуказанного испытания.

2.1.1.4. Сита

Сита с квадратными отверстиями производят из соответствующих материалов. Для неаналитических процедур могут быть использованы сита с круглыми отверстиями, диаметр которых в 1,25 раза превышает размер стороны квадратного отверстия сита соответствующего номера. Не должно быть взаимодействия между материалом, из которого изготовлено сито, и веществом, которое просеивают. Степень измельчения в частной фармакопейной статье указывают, используя номер сита, соответствующий номинальному размеру стороны отверстия в микрометрах, который приводится в скобках после названия вещества (таблица 2.1.1.4.-1).

Таблица 2.1.1.4.-1. - Характеристика сит

Максимальный допуск для размера отверстия (+X): не должно быть отверстий, размер которых превышает номинальный размер более чем на величину X:

где: - номинальный размер отверстия.

Допуск для среднего значения размера отверстия (+/- Y): средний размер отверстия не должен отклоняться от номинального размера более чем на величину +/- Y:

Промежуточный допуск (+Z): не более 6% общего числа отверстий могут иметь размеры между "номинальный +X" и "номинальный +Z":

Диаметр проволоки, применяемой для плетения металлической проволочной ткани, вставленной в рамку, представлен в таблице 2.1.1.4.-1. Номинальные размеры диаметра проволоки могут отклоняться от указанных значений d в пределах dmax и dmin. Пределы установлены в допустимом диапазоне +/- 15% от рекомендуемых номинальных размеров. Диаметр проволоки по всему ситу должен быть одинаковым.

2.1.1.5. Пробирки для сравнительных испытаний

Пробирки, используемые для сравнительных испытаний, - это специально подобранные пробирки из бесцветного стекла с одинаковым внутренним диаметром и прозрачным плоским дном.

Слой жидкости исследуют сверху вниз вдоль вертикальной оси пробирки на белом или, при необходимости, на черном фоне. Испытание проводят при рассеянном свете.

Принято использовать пробирки с внутренним диаметром 16 мм. Пробирки с большим внутренним диаметром могут быть использованы вместо вышеупомянутых при условии увеличения объема испытуемой жидкости настолько, чтобы высота жидкости в пробирках была не ниже, чем при аналогичном испытании с использованием жидкости в пробирках с внутренним диаметром 16 мм.

2.1.1.6. Индикаторные трубки

Индикаторные трубки - герметичные цилиндрические трубки, состоящие из инертного прозрачного материала и сконструированные с учетом возможности пропускания через них газа. Они содержат реагент, подходящий для визуализации обнаруживаемого вещества, адсорбированный на инертном носителе и, при необходимости, дополнительные верхние слои и/или адсорбирующие фильтры для удаления веществ, которые могут взаимодействовать с обнаруживаемым веществом. Слой индикатора содержит либо один реагент, позволяющий обнаружить определенное вещество, либо несколько реагентов для обнаружения нескольких веществ (однослойные и многослойные трубки).

Испытания проводят путем пропускания требуемого объема газа через индикаторную трубку. Длина окрашенного слоя или интенсивность изменения цвета на градуировочной шкале является функцией и мерой массовой концентрации определяемого компонента.

Проверка индикаторных трубок проводится в соответствии с инструкциями изготовителя.

Подготовка к измерению. Проводится согласно инструкциям изготовителя или следующим образом.

Устройство для подачи газа подсоединяют к регулятору давления с игольчатым клапаном. Соединяют гибкий шланг трубки с Т-образным участком клапана и продувают систему (рисунок 2.1.1.6.-1). Присоединяют открытый конец индикаторный трубки к короткому концу шланга и регулируют насосом объем анализируемого газа, проходящего через трубку. Записывают значения, соответствующие длине окрашенного слоя или интенсивности цвета на градуировочной шкале. При отрицательном результате анализа индикаторная трубка должна быть проверена с помощью калибровочного газа, содержащего соответствующую примесь.

Рисунок 2.1.1.6.-1. - Прибор для индикаторных трубок. 1. Подача газа; 2. Регулятор давления; 3. Игольчатый клапан; 4. Т-образный участок; 5. Индикаторная трубка; 6. Насос для индикаторной трубки; 7. Открытый конец для выхода газа в атмосферу.

Ввиду широкого использования разнообразных компрессорных масел необходимо проверить реакцию трубки для масел на используемое масло. Информация о реакционной способности для различных масел приводится в сопроводительном листке, прилагаемом к трубке. Если используемое масло не указано в сопроводительном листке, изготовитель трубки должен проверить реакционную способность и, при необходимости, обеспечить прибор специальной трубкой для данного масла.

Индикаторная трубка для углерода диоксида. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикаторов: гидразина и кристаллического фиолетового. Минимальная определяемая концентрация - 100 ppm с относительным стандартным отклонением +/- 15%.

Индикаторная трубка для серы диоксида. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикаторов: йода и крахмала. Минимальная определяемая концентрация - 0,5 ppm с относительным стандартным отклонением +/- 15%.

Индикаторная трубка для масел. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикатора - серной кислоты. Минимальная определяемая концентрация - 0,1 мг/м3 с относительным стандартным отклонением +/- 30%.

Индикаторная трубка для азота монооксида и азота диоксида. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для окисляющего слоя (соль Cr (VI)) и индикатора - дифенил-бензидина. Минимальная определяемая концентрация - 0,5 ppm с относительным стандартным отклонением +/- 15%.

Индикаторная трубка для углерода монооксида. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикаторов: йода (V) оксида, селена диоксида и серной кислоты дымящей. Минимальная определяемая концентрация - 5 ppm или менее с относительным стандартным отклонением +/- 15%.

Индикаторная трубка для сероводорода. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикатора - соли свинца. Минимальная определяемая концентрация - 1 ppm или менее с относительным стандартным отклонением +/- 10%.

Индикаторная трубка для паров воды. Герметичная стеклянная трубка, содержащая адсорбирующие фильтры и подходящие носители для индикатора - магния перхлората. Минимальная определяемая концентрация - 67 ppm или менее с относительным стандартным отклонением +/- 20%.

2.1.2.1. Прозрачность и степень опалесценции жидкостей

ВИЗУАЛЬНЫЙ МЕТОД

Для определения прозрачности и степени мутности жидкостей используют одинаковые пробирки из бесцветного, прозрачного и нейтрального стекла с плоским дном, которые имеют внутренний диаметр от 15 мм до 25 мм; слой испытуемой жидкости высотой 40 мм. Жидкость сравнивают со свежеприготовленной суспензией сравнения (высота слоя 40 мм) при рассеянном дневном освещении через 5 мин после приготовления суспензии сравнения, просматривая объекты вдоль вертикальной оси пробирок на черном фоне. Рассеянный свет должен быть таким, чтобы суспензия сравнения I легко отличалась от воды P., а суспензия сравнения II легко отличалась от суспензии сравнения I.

Прозрачными считаются жидкости, которые по прозрачности не отличаются от воды P, или растворителя, который используют при приготовлении раствора в описанных выше условиях, или которые не превышают по интенсивности мутность суспензии сравнения I.

Раствор гидразина сульфата. 1,0 г гидразина сульфата P растворяют в воде P и доводят водой P до объема 100,0 мл. Раствор выдерживают в течение 4 - 6 ч.

Раствор гексаметилентетрамина. 2,5 г гексаметилентетрамина P растворяют в 25,0 мл воды P в колбе с притертой пробкой вместимостью 100 мл.

Первичная опалесцирующая суспензия (суспензия формазина). 25,0 мл раствора гидразина сульфата прибавляют к приготовленному раствору гексаметилентетрамина, перемешивают и выдерживают в течение 24 ч. Суспензия стабильна в течение 2 месяцев при хранении в стеклянной посуде, которая не имеет дефектов поверхности. Частицы суспензии могут прилипать к стеклу, поэтому перед применением суспензию тщательно взбалтывают.

Стандарт опалесценции. 15,0 мл первичной опалесцирующей суспензии доводят водой P до объема 1000,0 мл. Срок годности стандарта опалесценции составляет не более 24 ч.

Суспензии сравнения. Приготовление суспензий сравнения проводят в соответствии с таблицей 2.1.2.1.-1. Стандарт опалесценции и воду P смешивают и встряхивают непосредственно перед применением.

Таблица 2.1.2.1.-1. - Приготовление суспензий сравнения

Стандарт мутности. Суспензия формазина, приготовленная смешиванием равных объемов раствора гидразина сульфата и раствора гексаметилентетрамина, является первичной суспензией сравнения с 4000 NTU (Nephelometric Turbidity Units - нефелометрические единицы мутности). Суспензии сравнения I, II, III и IV имеют значения 3 NTU, 6 NTU, 18 NTU и 30 NTU соответственно. Стабилизированные суспензии формазина, пригодные для приготовления стабильных разведенных стандартов мутности, являются коммерчески доступными и могут быть использованы в случае, если выдерживают сравнение со стандартами, приготовленными как указано выше.

Формазин обладает рядом характеристик, обуславливающих его широкое использование в качестве стандарта для определения мутности. Он может быть воспроизводимо приготовлен из предварительно проанализированных реактивов. Физические характеристики позволяют использовать его в качестве стандарта для калибровки светорассеяния. Полимер формазин состоит из цепей различной длины, которые принимают случайные конфигурации. Это приводит к получению частиц с широким спектром форм и размеров, аналитически соответствующих частицам с другими возможными размерами и формами, находящимся в испытуемых образцах. Благодаря трассируемости, воспроизводимости и светорассеивающим свойствам формазина инструментальные калибровочные алгоритмы и критерии выполнения основаны на этом стандарте.

ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ

ВВЕДЕНИЕ

Степень мутности раствора может быть определена с помощью инструментального измерения поглощения или рассеяния света за счет субмикроскопических неоднородностей оптической плотности опалесцирующих растворов и суспензий. На практике используются 2 метода: нефелометрия и турбидиметрия. Для измерения мутности окрашенных испытуемых образцов используют методы относительной турбидиметрии и нефелометрии, основанные на соотношении выбранных сигналов.

Эффект рассеяния света суспендированными частицами может быть измерен с помощью либо проходящего света (турбидиметрия), либо рассеянного света (нефелометрия). Относительная турбидиметрия сочетает принципы и нефелометрии, и турбидиметрии. Тубидиметрия и нефелометрия могут использоваться в случае со слегка опалесцирующими суспензиями. Должны использоваться только суспензии сравнения, приготовленные при четко определенных условиях. Для количественных определений необходимым является построение калибровочного графика, так как зависимость между оптическими свойствами суспензий и концентрации диспергированной фазы является в лучшем случае полуэмпирической.

Определение опалесценции окрашенных жидкостей проводят методом относительной турбидиметрии или нефелометрии, основанной на соотношении выбранных сигналов, так как окрашивание оказывает негативное воздействие, ослабляя как падающий, так и рассеянный свет, и уменьшает значение мутности. Эффект настолько велик, что даже в случае умеренно окрашенных образцов обычные нефелометры не могут быть использованы.

Инструментальная оценка прозрачности и опалесценции является более селективным методом, который не зависит от остроты зрения аналитика. Числовые результаты более наглядны для мониторинга качества и контроля процесса, особенно в проверке стабильности при хранении. Например, предварительные числовые данные по стабильности могут быть использованы для определения возможности того, что данная партия лекарственного препарата или фармацевтической субстанции превысит предельное значение для срока годности до окончания срока хранения.

НЕФЕЛОМЕТРИЯ

При просматривании суспензии под определенным углом к направлению падающего света система кажется мутной вследствие отражения света от частичек суспензии (эффект Тиндаля). Определенная часть светового луча, попадающего в мутную жидкость, проходит через нее, другая часть поглощается, а оставшаяся часть рассеивается суспендированными частицами. Если измерение проводят под углом 90° к падающему лучу света, рассеянный суспендированными частицами свет может быть использован для определения их концентрации, при условии, что количество и размер частиц, влияющих на рассеяние, остается постоянным. Суспензия сравнения должна иметь постоянную степень мутности, а испытуемый образец и суспензии сравнения должны быть приготовлены в идентичных условиях. Эффект Тиндаля зависит и от числа частиц, и от их размеров. Нефелометрические данные более достоверны при низкой мутности суспензий, когда наблюдается линейная зависимость между значением нефелометрической единицы мутности (NTU) и относительным сигналом детектора. При возрастании степени мутности падающий свет попадает не на все частицы, а рассеянное излучение других частиц поглощается на пути к детектору. Максимальное нефелометрическое значение, при котором может быть проведено достоверное измерение, находится в диапазоне 1750 - 2000 NTU. Для подтверждения линейности необходимо построение калибровочного графика как минимум по четырем концентрациям.

ТУРБИДИМЕТРИЯ

Мутность - это оптическое свойство, возникающее при взаимодействии между светом и суспендированными в жидкости частицами. Это определение оптического свойства, обусловливающего то, что падающий свет в большей степени рассеивается или поглощается, чем проходит через испытуемый образец по прямой. Количество твердых частиц в суспензии может быть определено с помощью измерения интенсивности прошедшего света. Линейная зависимость между мутностью и концентрацией наблюдается в случае однородности и гомогенности размера частиц в суспензии. Это справедливо только для очень разведенных суспензий, содержащих маленькие частицы. Для подтверждения линейности необходимо построение калибровочного графика как минимум по четырем концентрациям.

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ ТУРБИДИМЕТРИЯ

В относительной турбидиметрии находят отношение интенсивности прошедшего света к интенсивности рассеянного света под углом 90°. Проведение такого испытания компенсирует влияние окрашивания испытуемого образца. Этого эффекта можно добиться также за счет использования в качестве источника света инфракрасного светоиспускающего диода при длине волны 860 нм. Фотодиодные детекторы прибора получают и измеряют интенсивность рассеянного света под углом 90°, а также интенсивность рассеяния в прямом направлении (отраженный свет) перед испытуемым образцом и интенсивность света, прошедшего непосредственно через испытуемый образец. Измеренные результаты в единицах NTU (отношение) рассчитываются как отношение интенсивности рассеянного света под углом 90° к сумме интенсивности рассеяния в прямом направлении и интенсивности прошедшего света. В относительной турбидиметрии влияние постороннего света становится незначительным. Нефелометры используют для измерения степени мутности бесцветных жидкостей.

Определение степени мутности суспензий сравнения I - IV с помощью относительной турбидиметрии показало, что зависимость между концентрациями и измеренными значениями NTU является линейной (см. таблицу 2.1.2.1.-2). Суспензии сравнения I - IV могут быть использованы для калибровки прибора.

Таблица 2.1.2.1.-2. - Значения опалесценции для различных суспензий формазина

ИНСТРУМЕНТАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПАЛЕСЦЕНЦИИ

Требования, приведенные в частных фармакопейных статьях, указаны в терминах для визуального определения степени мутности в сравнении с конкретной суспензией сравнения. Для подтверждения соответствия требованиям, приведенным в частных фармакопейных статьях, могут быть использованы также инструментальные методы определения степени мутности при условии, что прибор соответствует требованиям, указанным ниже, и если проведена калибровка с использованием суспензий сравнения I - IV и воды P или используемого растворителя.

Прибор. В качестве источников света в приборах для относительной турбидиметрии или нефелометрах, использующих соотношение выбранных сигналов, используют вольфрамовую лампу со спектральной чувствительностью около 550 нм, работающую при температуре 2700 К, или инфракрасный светоиспускающий диод, имеющий максимум испускания при 860 нм со спектральной полосой пропускания 60 нм. Могут использоваться и другие подходящие источники света. В качестве детекторов, записывающих изменения в рассеянии или пропускании света испытуемым образцом, обычно используют кремниевые фотодиоды и фотоумножители. Рассеянный свет под углом (90 +/- 2,5)° регистрируется первичным детектором. Остальные детекторы регистрируют интенсивность рассеяния в прямом и в обратном направлениях, а также интенсивность проходящего света. Используемые приборы калибруют с использованием стандартов с известной степенью мутности; кроме этого, приборы должны быть способны к автоматическому определению степени мутности. Результаты испытания, выраженные в NTU, считываются непосредственно с дисплея прибора и сравниваются со спецификацией, приведенной в частной фармакопейной статье.

Прибор считают пригодным, если он соответствует следующим техническим условиям.

- Единицы измерения: NTU. NTU основана на мутности первичного стандартного образца формазина. Также могут использоваться FTU (Formazin Turbidity Units - единицы мутности по формазину) или FNU (Formazin Nephelometry Units - формазиновые нефелометрические единицы), которые эквивалентны NTU при низких значениях (до 40 NTU). Эти единицы используются во всех трех инструментальных методах (нефелометрия, турбидиметрия и относительная турбидиметрия).

- Диапазон измерений: от 0,01 NTU до 1100 NTU.

- Разрешение: 0,01 NTU в диапазоне (0 - 10) NTU; 0,1 NTU в диапазоне (10 - 100) NTU; 1 NTU в диапазоне более 100 NTU. Прибор калибруют и контролируют с использованием суспензий сравнения формазина.

- Точность: в диапазоне (0 - 10) NTU: +/- (2% от показания прибора +0,01) NTU; в диапазоне (10 - 1000) NTU: +/- 5%.

- Повторяемость: в диапазоне 1 - 10 NTU: +/- 0,01 NTU; в диапазоне (10 - 1000) NTU: +/- 2% от измеренного значения.

- Калибровка: используют 4 суспензии сравнения формазина в интересующем диапазоне. Могут быть использованы суспензии сравнения, описанные выше, или подходящие стандартные образцы, откалиброванные по первичным суспензиям сравнения.

- Посторонний свет: посторонний свет является существенным источником ошибок при низких значениях турбидиметрических измерений; посторонний свет попадает на оптическую систему детектора, но приходит не от испытуемого образца; менее 0,15 NTU в диапазоне (0 - 10) NTU, менее 0,5 NTU в диапазоне (10 - 1000) NTU.

Приборы, отвечающие требованиям, указанным выше, и поверенные с использованием суспензий сравнения, описанных в разделе "Визуальный метод", могут быть использованы для подтверждения соответствия требованиям частной фармакопейной статьи вместо визуального определения.

Могут быть использованы приборы с характеристиками (диапазоном измерения, разрешением, точностью, повторяемостью), отличными от указанных выше, при условии, что они полностью валидированы и подходят для предполагаемого использования. Для отдельных испытуемых фармацевтических субстанций/лекарственных препаратов для подтверждения возможности использования также должна быть валидирована методика испытания. Прибор и методология не должны противоречить свойствам испытуемого образца.

2.1.2.2. Окраска и интенсивность окраски жидкостей

Определение степени окрашивания жидкостей и растворов в ряду коричневый - желтый - красный проводят визуально путем сравнения с соответствующими растворами сравнения одним из двух описанных ниже методов, как указано в частной фармакопейной статье.

Использование инструментальных фармакопейных методов для определения окраски и интенсивности окраски жидкостей допускается при наличии соответствующей валидации.

Раствор считается бесцветным, если он выдерживает сравнение с водой P или растворителем, или окрашен не более интенсивно, чем раствор сравнения B9.

МЕТОД I

2,0 мл испытуемой жидкости сравнивают с 2,0 мл воды P, растворителя или раствора сравнения (см. таблицы растворов сравнения), указанного в частной статье, используя одинаковые пробирки из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с внешним диаметром 12 мм. Сравнение окраски проводят при дневном освещении в рассеянном отраженном свете, просматривая объекты горизонтально (перпендикулярно оси пробирок) на белом матовом фоне.

МЕТОД II

Испытуемую жидкость высотой слоя 40 мм сравнивают со слоем 40 мм воды P, растворителя или раствора сравнения (см. таблицы растворов сравнения), указанного в частной статье, используя одинаковые пробирки из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским дном, которые имеют внутренний диаметр от 15 мм до 25 мм. Сравнение окраски проводят при дневном освещении в рассеянном отраженном свете, просматривая объекты вдоль вертикальной оси пробирок на белом фоне.

РЕАКТИВЫ

ПЕРВИЧНЫЕ РАСТВОРЫ

Желтый раствор. 46 г железа (III) хлорида P растворяют в 900 мл смеси хлороводородная кислота P - вода P (25:975, об/об) и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Определяют концентрацию полученного раствора и разводят раствор этим же растворителем таким образом, чтобы содержание FeCl3·6H2O в 1 мл равнялось 45,0 мг.

Раствор хранят в защищенном от света месте.

Определение концентрации. 10,0 мл полученного раствора помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют 15 мл воды P, 5 мл хлороводородной кислоты P и 4 г калия йодида P, колбу закрывают и выдерживают в течение 15 мин в темном месте. Прибавляют 100 мл воды Р и выделившийся йод титруют 0,1 M раствором натрия тиосульфата, прибавляя в конце титрования в качестве индикатора 0,5 мл крахмала раствора.

1 мл 0,1 M раствора натрия тиосульфата соответствует 27,03 мг FeCl2·6H2O.

Красный раствор. 60 г кобальта хлорида P растворяют в 900 мл смеси хлороводородная кислота P - вода P (25:975, об/об) и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Определяют концентрацию полученного раствора и разводят раствор этим же растворителем таким образом, чтобы содержание CoCl2·6H2O в 1 мл равнялось 59,5 мг.

Определение концентрации. 5,0 мл полученного раствора помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют 5 мл раствора водорода пероксида разбавленного P и 10 мл раствора 300 г/л натрия гидроксида P, осторожно кипятят в течение 10 минут, охлаждают и прибавляют 60 мл серной кислоты разбавленной P и 2 г калия йодида P. Колбу закрывают и осторожно встряхивают до полного растворения осадка. Выделившийся йод титруют 0,1 M раствором натрия тиосульфата, прибавляя в конце титрования в качестве индикатора 0,5 мл крахмала раствора P и титруют до появления бледно-розового окрашивания.

1 мл 0,1 M раствора натрия тиосульфата соответствует 23,79 мг CoCl2·6H2O.

Синий раствор. 63 г Меди (II) сульфата пентагидрата P растворяют в 900 мл смеси хлороводородная кислота P - вода P (25:975, об/об) и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Определяют концентрацию полученного раствора и разводят раствор этим же растворителем таким образом, чтобы содержание CuSO4·5H2O в 1 мл равнялось 62,4 мг.

Определение концентрации. 10,0 мл полученного раствора помещают в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл воды P, 12 мл уксусной кислоты разбавленной P и 3 г калия йодида P. Выделившийся йод титруют 0,1 M раствором натрия тиосульфата, прибавляя в конце титрования в качестве индикатора 0,5 мл крахмала раствора P и титруют до появления бледно-коричневого окрашивания.

1 мл 0,1 M раствора натрия тиосульфата соответствует 24,97 мг CuSO4·5H2O.

СТАНДАРТНЫЕ РАСТВОРЫ

Пять стандартных растворов готовят с использованием трех первичных растворов, как указано в таблице 2.1.2.2.-1.

Таблица 2.1.2.2.-1.

Стандартные растворы

Растворы сравнения для методов I и II.

Растворы сравнения готовят с использованием пяти стандартных растворов, как указано в таблицах 2.1.2.2.-2 - 2.1.2.2.-6.

Таблица 2.1.2.2.-2. - Растворы сравнения B

Таблица 2.1.2.2.-3. - Растворы сравнения BY

Таблица 2.1.2.2.-4. - Растворы сравнения Y

Таблица 2.1.2.2.-5. - Растворы сравнения GY

Таблица 2.1.2.2.-6. - Растворы сравнения R

Хранение

Растворы сравнения для определения интенсивности окраски жидкостей по методу I могут храниться в защищенном от света месте в запаянных пробирках из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с внешним диаметром 12 мм.

Растворы сравнения для определения интенсивности окраски жидкостей по методу II готовят из стандартных растворов непосредственно перед применением.

2.1.2.3. Потенциометрическое определение pH

Значение pH водного раствора представляет собой отрицательный логарифм активности находящихся в нем ионов водорода, условно выражающее концентрацию ионов водорода в растворе. На практике это значение определяют экспериментально.

Значение pH испытуемого раствора связано со значением pH раствора сравнения (pHs) следующим уравнением:

где: E - электродвижущая сила ячейки с испытуемым раствором, выраженная в вольтах;

Es - Электродвижущая сила ячейки с раствором сравнения с известным pH (pHs), выраженная в вольтах;

k - коэффициент наклона (изменение потенциала при изменении значения pH на единицу и рассчитанное по уравнению Нернста), выраженный в вольтах (см. таблицу 2.1.2.3-1).

Потенциометрическое определение pH проводят путем измерения электродвижущей силы (ЭДС) гальванического элемента, составленного из погруженных в анализируемый раствор двух подходящих электродов; один из электродов чувствителен к ионам водорода (обычно это стеклянный электрод), другой - электрод сравнения (например, хлорсеребряный электрод). Часто вместе с температурным датчиком их объединяют в один компактный электрод.

Таблица 2.1.2.3.-1. - Значения k при различных температурах

Прибор. Измерительным прибором служит вольтметр с входным сопротивлением, как минимум в 100 раз превышающим сопротивление используемых электродов. Прибор обычно градуирован в единицах pH и имеет чувствительность, позволяющую провести измерение с точностью, по крайней мере, 0,05 единиц pH или 0,003 В.

Современные pH-метры являются микропроцессорными и управляются с помощью прошивки или программного обеспечения производителя прибора в соответствии с прилагаемыми инструкциями.

Обращение с электродами. Электроды хранят надлежащим образом и в соответствии с рекомендациями производителя (например, в растворе электролита или подходящем растворе для хранения). Перед измерением электроды проверяют визуально. Для пополняемых электродов проверяют, чтобы в стеклянном шарике отсутствовали пузырьки воздуха, и убеждаются в достаточном уровне внутреннего раствора электролита. Во время измерения отверстие пополнения должно оставаться открытым. Также рекомендуется проверять диафрагму электрода сравнения. Перед первым использованием электрода или если электрод хранился в отсутствии раствора электролита обычно необходимо проведение кондиционирования электрода в соответствии с рекомендациями производителя. Слишком медленная стабилизация значения pH (то есть большое время отклика), или смещение нулевой точки, уменьшение наклона или любые иные проблемы, наблюдаемые при калибровке, указывает на возможную необходимость очистки или замены электрода. Очистку проводят в зависимости от типа образца и в соответствии с руководством производителя. Очистку рекомендуется проводить регулярно.

Условия калибровки и измерений. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, все измерения проводят при той же температуре, при которой проводилась калибровка (+/- 2,5 °C), обычно при температуре от 20 °C до 25 °C. В таблице 2.1.2.3.-2 приведена зависимость значения pH от температуры для различных буферных растворов сравнения, используемых для калибровки. Используют температурные поправки в соответствии с инструкциями производителя.

Таблица 2.1.2.3.-2. - Значение pH буферных растворов сравнения при различных температурах

--------------------------------

<1> Изменение pH при изменении температуры на 1 градус по Цельсию.

Калибровка состоит из определения наклона (например, 95 - 105%) и смещения измерительной системы. Большинство коммерчески доступных pH-метров позволяют проводить самодиагностику или диагностику при включении, при этом, например, проверяемые наклон и асимметрия потенциала сравниваются со спецификацией производителя. Прибор калибруют с использованием не менее двух выбранных буферных растворов таким образом, чтобы ожидаемое значение pH испытуемого раствора лежало между значениями pH буферных растворов. Диапазон должен быть не менее двух единиц pH. Показание прибора для буферного раствора с промежуточным значением pH не должно отличаться более чем на 0,05 единиц pH от значения pH, соответствующего этому раствору.

Предпочтительно использовать коммерческие сертифицированные буферные растворы сравнения.

В качестве альтернативы буферные растворы могут быть приготовлены в соответствии с таблицей 2.1.2.3.-2. Данные растворы должны быть прослеживаемы до первичных стандартов.

Калибровка должна проводиться регулярно, желательно ежедневно перед использованием либо перед каждой серией измерений.

Электроды помещают в испытуемый раствор и считывают показания в тех же условиях, что и при использовании буферных растворов сравнения.

Если откалиброванная как указано выше система используется для измерения pH в суспензиях, эмульсиях или неводных или частично водных образцах, показания pH могут считаться, лишь аппроксимацией истинного значения. Для измерения pH таких смесей должны использоваться подходящие электроды.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ СРАВНЕНИЯ

0,05 M раствор калия тетраоксалата.

12,61 г C4H3KO8·2H2O растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

Насыщенный при 25 °C раствор калия гидротартрата. Избыток C4H5KO6 энергично встряхивают с водой, свободной от углерода диоксида, P при температуре 25 °C в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтруют или сливают. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

0,05 M раствор калия дигидроцитрата.

11,41 г C6H7KO7 растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

0,05 M раствор калия гидрофталата.

10,13 г C8H5KO4, предварительно высушенного при температуре (110 +/- 2) °C в течение 1 ч, растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

0,025 M раствор калия дигидрофосфата + 0,025 M раствор динатриягидрофосфата.

3,39 г KH2PO4 и 3,53 г Na2HPO4, предварительно высушенных при температуре (120 +/- 2) °C в течение 2 ч, растворяют в воде P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

0,0087 M раствор калия дигидрофосфата + 0,0303 M раствор динатриягидрофосфата. 1,18 г KH2PO4 и 4,30 г Na2HPO4, предварительно высушенных при температуре (120 +/- 2) °C в течение 2 часов, растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл.

0,01 M раствор натрия тетрабората. 3,80 г Na2B4O7·10H2O растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, Р и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл. Хранят в месте, защищенном от атмосферного углерода диоксида.

0,025 M раствор натрия карбоната + 0,025 M раствор натрия гидрокарбоната. 2,64 г Na2CO3 и 2,09 г NaHCO3 растворяют в воде P, свободной от углерода диоксида, P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл. Хранят в месте, защищенном от атмосферного углерода диоксида.

Насыщенный при 25 °C раствор кальция гидроксида. Избыток кальция гидроксида P встряхивают с водой P, свободной от углерода диоксида P, и сливают надосадочную жидкость при температуре 25 °C. Хранят в месте, защищенном от атмосферного углерода диоксида.

ХРАНЕНИЕ БУФЕРНЫХ РАСТВОРОВ

Буферные растворы хранят в подходящих химически стойких плотно укупориваемых контейнерах, таких как контейнеры из стекла класса I или полимерные контейнеры для водных растворов.

2.1.2.4. Определение приблизительного значения pH

Приблизительное значение pH определяют с помощью индикаторных полосок для определения pH. Кроме того, могут быть использованы индикаторы для определения pH, указанные в таблице 2.1.2.4.-1.

Таблица 2.1.2.4.-1. - Индикаторы для определения pH

2.1.2.5. Относительная плотность

Относительная плотность представляет собой отношение массы определенного объема вещества при температуре t1 к массе равного ему объема воды при температуре t2.

Если нет других указаний в частной фармакопейной статье, используют относительную плотность . Относительная плотность также часто выражается как . Может использоваться плотность , определяемая как масса единицы объема вещества при температуре 20 °C и выражаемая в килограммах на кубический метр или в граммах на кубический сантиметр (1 кг/м3 = 0,001 г/см3). Эти величины связаны между собой следующими уравнениями, в которых плотность выражена в граммах на кубический сантиметр:

Относительную плотность или плотность определяют с точностью до десятичных знаков, указанных в частной фармакопейной статье, с использованием пикнометра (для твердых веществ и жидкостей), гидростатических весов (для твердых веществ), ареометра (для жидкостей) или цифрового денсиметра (плотномера) с осциллирующим датчиком (для жидкостей и газов). Атмосферное давление в определениях с использованием взвешивания не учитывают, так как связанная с ним ошибка не превышает единицы в третьем десятичном знаке. Давление воздуха не оказывает влияние на определения с использованием денсиметра.

Денсиметр с осциллирующим датчиком. Прибор состоит из следующих основных составляющих:

- U-образная трубка, обычно из боросиликатного стекла, в которую помещают испытуемую жидкость;

- генератор магнитоэлектрического или пьезоэлектрического возбуждения, заставляющий колебаться U-образную трубку с характеристической частотой, зависящей от плотности испытуемой жидкости;

- измерительный аппарат, определяющий период колебаний (T), который может быть преобразован прибором непосредственно в плотность, либо использован для расчета плотности с использованием постоянных A и B как указано ниже.

Резонансная частота (f) является функцией константы упругости (c) и массы (m) системы:

Отсюда:

где: M - масса трубки;

V - внутренний объем трубки.

Введение двух постоянных и B = M / V приводит уравнение к классическому виду для осциллирующего датчика:

Постоянные A и B определяют для конкретного прибора, заполняя U-образную трубку двумя различными образцами с известными плотностями, например дегазированной водой P и воздухом. Может быть использован следующий способ дегазации: воду нагревают при аккуратном перемешивании до температуры около 41 °C, немедленно фильтруют под вакуумом через фильтр с размером пор 0,45 мкм или менее при интенсивном перемешивании и продолжают перемешивать под вакуумом в течение около 5 мин. Также может быть использован иной валидированный метод удаления растворенных газов.

Проверку получаемых данных проводят ежедневно с использованием дегазированной воды P. Результаты, полученные при проверке с использованием дегазированной воды P, не должны отличаться от стандартных значений ( г/см3, ) более чем на погрешность измерений, указанную в спецификации. Например, прибор с погрешностью измерений до +/- 0,0001 г/см3, считается пригодным для дальнейших измерений, если выдает значение 0,9982 +/- 0,0001 г/см3. В противном случае необходима повторная настройка. Регулярно должна проводиться калибровка с использованием сертифицированных стандартных образцов. Измерения должны проводиться при тех же условиях, что и калибровка. Перед помещением в трубку испытуемую жидкость при необходимости термостатируют при 20 °C для предотвращения образования пузырьков газа и для уменьшения времени, необходимого для измерения.

Факторы, влияющие на точность измерения:

- неравномерность температуры во всем объеме трубки;

- отсутствие линейности в диапазоне измеряемого значения плотности;

- мешающие резонансные эффекты;

- вязкость, вследствие чего растворы с вязкостью большей, чем у раствора, по которому проводилась калибровка, показывают плотность заметно более высокую, чем истинная.

Проблемы, связанные с эффектами отсутствия линейности и вязкости, могут быть решены при использовании для калибровки веществ со значениями плотности и вязкости близкими к таковым для испытуемой жидкости (+/- 5% для плотности и +/- 50% для вязкости). Денсиметр может иметь функцию для автоматической коррекции вязкости и для коррекции ошибок, связанных с отсутствием линейности и с изменениями температуры.

Прецизионность является функцией воспроизводимости и стабильности частоты осциллирующего датчика, которая зависит от стабильности объема, массы и константы упругости ячейки.

Денсиметры способны проводить измерения с точностью от 1·10-3 г/см3 до 1·10-5 г/см3 и повторяемостью от 1·10-4 г/см3 до 1·10-6 г/см3.

Определение плотности при помощи пикнометра проводят, как указано в методах 1 и 2, при помощи ареометра - как указано в методе 3, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Метод 1. Применяют в случае определения плотности жидкостей с точностью до 0,001 г/см3.

Чистый сухой пикнометр взвешивают с точностью до 0,0002 г, заполняют с помощью сухой воронки водой P чуть выше метки, закрывают пробкой и термостатируют в течение 20 мин при температуре (20 +/- 0,1) °C. При этой температуре доводят уровень воды в пикнометре до метки, быстро отбирая избыток воды с помощью пипетки или свернутой в трубку полоски фильтровальной бумаги. Пикнометр снова закрывают пробкой и термостатируют еще 10 мин, проверяя положение мениска по отношению к метке. Затем пикнометр вынимают из термостата, фильтровальной бумагой вытирают внутреннюю поверхность шейки пикнометра, а также весь пикнометр снаружи, выдерживают под стеклом весов в течение 10 мин и взвешивают с точностью, указанной выше.

Пикнометр освобождают от воды, высушивают, ополаскивая последовательно 96% спиртом P и эфиром P (сушить пикнометр путем нагревания не допускается), удаляют остаток эфира продуванием воздуха, заполняют пикнометр испытуемой жидкостью и затем проводят те же операции, что и с водой P.

Плотность (г/см3) рассчитывают по формуле:

где: m - масса пустого пикнометра, г;

m1 - масса пикнометра с водой P, г;

m2 - масса пикнометра с испытуемой жидкостью, г;

0,99703 - значение плотности воды при 20 °C, г/см3 (с учетом плотности воздуха);

0,0012 - значение плотности воздуха при 20 °C, г/см3 и барометрическом давлении 101,3 кПа (760 мм рт. ст.).

Метод 2. Применяют для определения плотности твердых жиров и воска с точностью до 0,001 г/см3.

Взвешивают пустой пикнометр, затем взвешивают тот же пикнометр, заполненный водой P. После этого воду удаляют и пикнометр высушивают. Все операции проводят, соблюдая условия, указанные в методе 1.

В пикнометр вливают при помощи пипетки или небольшой воронки с тонкооттянутым концом расплавленный жир или воск в таком количестве, чтобы он занимал от 1/3 до 1/2 объема пикнометра. Пикнометр выдерживают в течение 1 ч без пробки в горячей воде, затем охлаждают до температуры 20 °C, взвешивают, доводят до метки водой P при температуре 20 °C, вытирают насухо и снова взвешивают. В обеих фазах и на поверхности их раздела не должно быть пузырьков воздуха.

Плотность (г/см3) рассчитывают по формуле:

где: m - масса пустого пикнометра, г;

m1 - масса пикнометра с водой P, г;

m2 - масса пикнометра с испытуемым образцом, г;

m3 - масса пикнометра с испытуемым образцом и водой P, г.

Метод 3. Применяют в случае определения плотности жидкостей с точностью до 0,01 г/см3.

Испытуемую жидкость помещают в цилиндр и при температуре жидкости 20 °C осторожно опускают в нее чистый сухой ареометр, шкала которого позволяет определить ожидаемую величину плотности. Ареометр не выпускают из рук, пока не станет очевидным, что он плавает; при этом необходимо следить, чтобы ареометр не касался стенок и дна цилиндра. Отсчет плотности проводят через 3 - 4 мин после погружения ареометра по делению на шкале, соответствующему нижнему мениску жидкости (в случае определения темноокрашенных жидкостей отсчет производят по верхнему мениску). При отсчете глаз должен быть на уровне мениска. Определение плотности сильно летучих веществ ареометром не допускается.

2.1.2.6. Показатель преломления (индекс рефракции)

Показатель преломления среды относительно воздуха равняется отношению синуса угла падения луча света в воздухе к синусу угла преломления луча света в данной среде.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье определение показателя преломления проводят при температуре (20 +/- 0,5) °C при длине волны линии D спектра натрия ( нм); показатель преломления, определенный в таких условиях, обозначают символом .

Рефрактометры обычно определяют критический угол. В таком приборе главной частью является призма с известным показателем преломления, которая контактирует с испытуемой жидкостью.

Для калибровки прибора используют сертифицированные стандартные образцы.

При использовании белого света рефрактометры должны быть оборудованы компенсационной системой. Прибор должен давать показания с точностью как минимум до третьего десятичного знака и обеспечивать возможность проведения операций при заданной температуре. Цена деления термометра не должна превышать 0,5 °C.

2.1.2.7. Оптическое вращение

Оптическое вращение - это свойство вещества вращать плоскость поляризации поляризованного света.

Оптическое вращение считается положительным (+) для правовращающих веществ (то есть тех, которые вращают плоскость поляризации по часовой стрелке) и отрицательным (-) для левовращающих веществ.

Удельное оптическое вращение , выраженное в радианах (рад), представляет собой оптическое вращение, которое производит слой жидкости или раствора толщиной 1 м, содержащий 1 кг/м3 оптически активного вещества при прохождении через него поляризованного света с длиной волны при температуре t. Для практических целей удельное оптическое вращение обычно выражают в миллирадианметрах квадратных на килограмм (мрад·м2·кг-1).

В Фармакопее используются следующие общепринятые определения.

Угол оптического вращения жидких веществ представляет собой угол вращения а плоскости поляризации, выраженный в градусах (°), при длине волны линии D спектра натрия ( нм), измеренный при температуре 20 °C в толщине слоя 1 дм. Для растворов способ приготовления указывают в частной фармакопейной статье.

Удельное оптическое вращение жидкости представляет собой угол оптического вращения плоскости поляризации, выраженный в градусах (°), при длине волны линии D спектра натрия ( нм), измеренный при температуре 20 °C, рассчитанный для толщины слоя 1 дм испытуемого вещества и деленный на плотность, выраженную в граммах на кубический сантиметр.

Удельное оптическое вращение вещества в растворе представляет собой угол оптического вращения плоскости поляризации, выраженный в градусах (°), при длине волны линии D спектра натрия ( нм), измеренный при температуре 20 °C в растворе испытуемого вещества, и рассчитанный для слоя 1 дм в пересчете на содержание вещества 1 г/мл в растворе. Для удельного вращения вещества в растворе всегда указывают используемый растворитель и концентрацию раствора.

В Фармакопее удельное оптическое вращение выражают без размерности; реальная размерность выражается в градус-миллилитрах на дециметр-грамм [(°)·мл·дм-1·г-1].

Пересчет удельного вращения в единицах по Международной Системе в единицы, используемые Фармакопеей, проводят по формуле:

В отдельных случаях, указанных в частной фармакопейной статье, угол вращения может быть измерен при температурах, отличных от 20 °C, и при других длинах волн.

Используемый поляриметр должен обеспечивать точность измерения до 0,01°. Шкалу обычно проверяют с помощью сертифицированных кварцевых пластинок. Линейность шкалы может быть проверена с помощью растворов сахарозы.

Методика. Определяют ноль поляриметра и угол оптического вращения плоскости поляризации при длине волны линии D спектра натрия ( нм) при температуре (20 +/- 0,5) °C. Измерения оптического вращения могут проводиться при других температурах только в тех случаях, если в частной фармакопейной статье указан способ учета температуры. Ноль прибора определяют с закрытой трубкой; для жидкостей - с пустой трубкой; для растворов твердых веществ - с трубкой, заполненной соответствующим растворителем.

Удельное оптическое вращение рассчитывают по следующим формулам.

Для жидкостей:

Для веществ в растворе:

где: c - концентрация вещества в растворе, г/л.

Содержание c (г/л) или c' (% (м/м)) растворенного вещества рассчитывают по формулам:

где: - угол оптического вращения, измеренный при температуре (20 +/- 0,5) °c, в градусах;

l - длина поляриметрической трубки, в дециметрах;

- плотность при температуре 20 °C, в граммах на кубический сантиметр. В фармакопейном анализе плотность заменяют относительной плотностью.

2.1.2.8. Вязкость

Динамическая вязкость, или коэффициент вязкости - это тангенциальная сила, действующая на единицу поверхности, которая также называется напряжением сдвига , выраженная в паскалях (Па), которую необходимо приложить для того, чтобы переместить слой жидкости площадью 1 м2 со скоростью (v) 1 метр в секунду (м·с-1) на расстояние (x) 1 м относительно другого слоя, параллельно поверхности скольжения,

Величина dv/dx представляет собой градиент скорости и обусловливает скорость сдвига D, выраженную в обратных секундах (с-1). Таким образом, .

Единицей динамической вязкости является паскаль-секунда (Па·с). Чаще всего используется дольная единица - миллипаскаль-секунда (мПа·с).

Кинематическая вязкость V, выраженная в метрах квадратных в секунду (м2·с-1), рассматривается как отношение величины динамической вязкости к плотности жидкости , выраженной в килограммах на метр кубический (кг·/м3), измеренной при этой же температуре: . Кинематическую вязкость обычно выражают в миллиметрах квадратных на секунду (мм2·с-1).

Для определения вязкости ньютоновских жидкостей можно использовать капиллярный вискозиметр; для определения вязкости как ньютоновских, так и неньютоновских жидкостей можно использовать ротационный вискозиметр. Допускается использование и других типов вискозиметров с учетом того, что правильность и прецизионность измерений не будут уступать таковым для указанных в настоящей статье вискозиметров.

2.1.2.9. Метод капиллярной вискозиметрии

Определение вязкости проводят, используя подходящий капиллярный вискозиметр, при температуре (20 +/- 0,1) °C при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Время вытекания от одной отметки вискозиметра до другой измеряется секундомером с точностью до одной пятой секунды. Полученные данные считаются достоверными при условии, что результаты двух последовательных измерений отличаются не более чем на 1%.

Время вытекания испытуемой жидкости определяют как среднее не менее трех измерений.

Динамическую вязкость (2.1.2.8), выраженную в миллипаскаль-секундах (мПа·с), рассчитывают по формуле:

где: k - постоянная вискозиметра, в миллиметрах квадратных на секунду в квадрате (мм2·с-2);

- плотность испытуемой жидкости, в миллиграммах на миллиметр кубический (мг·мм-3), полученная умножением относительной плотности на 0,9982;

t - время вытекания испытуемой жидкости, в секундах (с).

Постоянную k определяют с использованием соответствующей жидкости для калибровки вискозиметров,

Кинематическую вязкость, выраженную в миллиметрах квадратных на секунду (мм2·с-1), рассчитывают по формуле:

Определение вязкости может проводиться при помощи прибора (предложен Международной организацией по стандартизации), характеристики которого представлены на рисунке 2.1.2.9.-1 и в таблице 2.1.2.9.-1.

Рисунок 2.1.2.9-1. - Вискозиметр с висячим уровнем. Размеры приведены в миллиметрах

Таблица 2.1.2.9.-1. - Характеристики вискозиметра с висячим уровнем

Минимальное время вытекания должно быть 350 с для размера 1 и 200 с - для остальных размеров.

Методика. Испытуемую жидкость, имеющую температуру 20 °C, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, заливают в вискозиметр через трубку (L) в таком количестве, чтобы заполнить расширение (A), но при этом уровень жидкости в расширении (B) должен остаться ниже выхода к вентиляционной трубке (M). Вискозиметр в вертикальном положении погружают в водяную баню при температуре (20 +/- 1) °C, если в частной фармакопейной статье не указана иная температура, удерживая его в этом положении не менее 30 минут для установления температурного равновесия. Трубку (M) закрывают и повышают уровень жидкости в трубке (N) таким образом, чтобы она находилась примерно на 8 мм выше метки (E). Удерживают жидкость на этом уровне, закрыв трубку (N) и открыв трубку (M). Затем открывают трубку (N) и измеряют время, за которое уровень жидкости снизится от метки (E) до метки (F), секундомером с точностью до одной пятой секунды.

Работа с прибором, описанным выше, допускает использование вискозиметров капиллярных стеклянных с висячим уровнем (например, вискозиметры капиллярные стеклянные типа ВПЖ-1), параметры которого аналогичны приведенным на рисунке 2.1.2.9.-1. Вязкость измеряют в соответствии с инструкцией по применению вискозиметра.

Для определения относительной вязкости жидкости измеряют время t0ср вытекания между верхней и нижней отметкой вискозиметра той жидкости, относительно которой проводят измерение . Затем в том же чистом и сухом вискозиметре при тех же условиях определяют время вытекания tср испытуемой жидкости.

Одновременно измеряют плотность жидкостей, которые изучаются, пикнометром ( и ) при той же температуре, при которой определяют вязкость, и рассчитывают относительную вязкость по формуле:

Для определения характеристической вязкости готовят не менее пяти испытуемых растворов разной концентрации. При этом должно выполняться условие возможности линейной экстраполяции приведенной вязкости к нулевой концентрации, то есть нужно выбирать минимальные концентрации раствора в пределах чувствительности и точности метода измерения. Для каждой концентрации раствора определяют tср и рассчитывают приведенную вязкость. Затем строят зависимость от концентрации c и графически или линейным методом наименьших квадратов экстраполируют приведенную вязкость к нулевой концентрации, то есть находят характеристическую вязкость.

2.1.2.10. Метод ротационной вискозиметрии

Принцип метода заключается в измерении силы, действующей на ротор (вращающий момент) во время его вращения с постоянной угловой скоростью (скорость вращения) в жидкости. Ротационные вискозиметры используются для измерения вязкости ньютоновских жидкостей (вязкость не зависит от напряжения сдвига) и неньютоновских жидкостей (вязкость зависит от напряжения сдвига, кажущаяся вязкость). Ротационные вискозиметры могут быть разделены на две группы, а именно: абсолютные вискозиметры и относительные вискозиметры. В абсолютных вискозиметрах время вытекания в используемой геометрии хорошо известно. Результаты измерений представляются в единицах абсолютной вязкости, которые могут сравниваться с любыми другими абсолютными значениями. В относительных вискозиметрах время вытекания в используемой геометрии не определено. Результаты измерений представляются в единицах относительной вязкости, которые не могут быть соотнесены с абсолютными значениями вязкости или со значениями относительной вязкости, полученными не на том же самом приборе.

Для данных диапазонов вязкости и для различных скоростей вращения доступны различные измерительные системы.

ПРИБОР

Наиболее обычными являются следующие типы приборов.

КОНЦЕНТРИЧЕСКИЕ ЦИЛИНДРИЧЕСКИЕ ВИСКОЗИМЕТРЫ (АБСОЛЮТНЫЕ ВИСКОЗИМЕТРЫ)

В концентрических цилиндрических вискозиметрах (коаксиальный двойной цилиндрический вискозиметр или просто коаксиальный вискозиметр) вязкость определяют, помещая испытуемую жидкость в зазор между внутренним и внешним цилиндрами. При проведении измерений вращают либо внутренний цилиндр (вискозиметр типа Сирла (Searle)), либо внешний цилиндр (вискозиметр типа Куэтта (Couette)), как показано на рисунках 2.1.2.10.-1 и 2.1.2.10.-2 соответственно. Для ламинарного потока вязкость (или кажущуюся вязкость) , выраженную в паскаль-секундах (Па·с), рассчитывают по формуле:

где: M - вращающий момент, действующий на цилиндрическую поверхность, в ньютон-метрах;

- угловая скорость, в радианах в секунду;

h - глубина погружения внутреннего цилиндра в жидкую среду, в метрах;

Ri - радиус внутреннего цилиндра, в метрах;

R0 - радиус внешнего цилиндра, в метрах;

k - постоянная прибора, в радианах на метр кубический.

Рисунок 2.1.2.10.-1.

Рисунок 2.1.2.10.-2

Для неньютоновских жидкостей необходимо указывать напряжение при сдвиге или скорость сдвига , при которых измеряется вязкость. В узком интервале условий (подходящих для абсолютных вискозиметров) наблюдается пропорциональная зависимость между M и , а также между и :

где: A и B - постоянные прибора, которые рассчитывают по следующим формулам:

- для концентрической поверхности:

- для устройства конус-плита:

где: M - вращающий момент, действующий на коническую или цилиндрическую поверхность, в ньютон-метрах;

- угловая скорость, в радианах в секунду;

Ri - радиус внутреннего цилиндра, в метрах;

R0 - радиус внешнего цилиндра, в метрах;

R - радиус конуса, в метрах;

h - глубина погружения внутреннего цилиндра в жидкую среду, в метрах;

- угол между плоским диском и конусом, в радианах;

- напряжение при сдвиге, в паскалях (Па);

- скорость сдвига, в обратных секундах (с-1).

ВИСКОЗИМЕТРЫ КОНУС-ПЛИТА (АБСОЛЮТНЫЕ ВИСКОЗИМЕТРЫ)

В вискозиметрах типа конус-плита жидкость помещают в промежуток между плоским диском и конусом с определенным углом. Определение вязкости проводят, вращая конус или плоский диск, как показано на рисунках 2.1.2.10.-3 или 2.1.2.10.-4 соответственно. Вязкость (или кажущуюся вязкость) , выраженную в паскаль-секундах (Па·с) для ламинарного потока рассчитывают по формуле:

где: M - вращающий момент, действующий на коническую поверхность или поверхность плоского диска, в ньютон-метрах;

- угловая скорость, в радианах в секунду;

- угол между плоским диском и конусом, в радианах;

R - радиус конуса, в метрах;

k - постоянная прибора, в радианах на метр кубический.

Постоянные A и B прибора определяют аналогично как для концентрических цилиндрических вискозиметров.

Рисунок 2.1.2.10.-3.

Рисунок 2.1.2.10.-4.

ШПИНДЕЛЬНЫЕ ВИСКОЗИМЕТРЫ (ОТНОСИТЕЛЬНЫЕ ВИСКОЗИМЕТРЫ)

В шпиндельном вискозиметре вязкость определяют с помощью вращающегося шпинделя (например, цилиндрического или дискообразного, как показано на рисунках 2.1.2.10.-5 и 2.1.2.10.-6 соответственно), помещенного в жидкость. Относительные значения вязкости (или кажущейся вязкости) могут быть рассчитаны непосредственно с использованием коэффициентов пересчета исходя из показаний прибора при данной скорости вращения.

Рисунок 2.1.2.10.-5.

Рисунок 2.1.2.10.-6.

В общем случае постоянная k прибора может быть определена для разных скоростей вращения с использованием жидкости, сертифицированной для калибровки вискозиметра. После этого вязкость рассчитывают по формуле:

МЕТОДИКА

Измеряют вязкость (или кажущуюся вязкость) в соответствии с инструкциями производителя ротационного вискозиметра. Температуру, при которой измеряют вязкость, указывают в частной фармакопейной статье. Для неньютоновских систем в частной фармакопейной статье указывают тип используемого вискозиметра и, если используются абсолютные вискозиметры, угловую скорость или скорость сдвига, при которых производится измерение. В случае если точно получить необходимую скорость сдвига невозможно, используют значения скорости сдвига выше и ниже необходимого и интерполируют.

В случае относительных вискозиметров скорость сдвига не является постоянной по всему объему образца и, таким образом, она не может быть определена. В этих условиях вязкость неньютоновских жидкостей, определенная по вышеприведенной формуле, имеет относительный характер, который зависит от типа шпинделя, угловой скорости, а также от размеров контейнера для образцов ( = не менее 80 мм) и глубины погружения шпинделя. Получаемые результаты сопоставимы только при соблюдении строго одинаковых условий эксперимента.

2.1.2.11. Температурные пределы перегонки

Температурные пределы перегонки представляют собой интервал температур, приведенных к давлению 101,3 кПа (760 мм рт. ст.), в пределах которого перегоняется жидкость или некоторая ее фракция в следующих условиях.

Прибор. Прибор (рисунок 2.1.2.11.-1) состоит из перегонной колбы (A), прямого холодильника (B), присоединенного к отводной трубке перегонной колбы, и вставной трубки (аллонжа) (C), присоединенной к концу холодильника. В качестве альтернативы, нижний конец холодильника может быть изогнут, для того чтобы исключить аллонж. В горловину перегонной колбы помещают термометр таким образом, чтобы верхний конец шарика термометра находился на 5 мм ниже нижнего края отводной трубки перегонной колбы. Используют термометр с диапазоном шкалы не менее 50 °C и ценой деления 0,2 °C. Во время испытания колбу, включая горловину, защищают от охлаждения подходящим экраном.

Рисунок 2.1.2.11.-1.

- Прибор для определения температурных пределов перегонки. Размеры приведены в миллиметрах.

Методика. 50,0 мл испытуемой жидкости и несколько кусочков пористого керамического материала помещают в колбу (A). Для сбора отгона используют цилиндр вместимостью 50 мл с ценой деления 1 мл. Для жидкостей, кипящих при температуре ниже 150 °C, применяют охлаждение циркулирующей водой. Колбу нагревают таким образом, чтобы быстро достичь кипения, и отмечают температуру, при которой в цилиндр поступает первая капля отгона. Устанавливают нагревание, которое обеспечивает скорость перегонки от 2 до 3 мл в минуту, и отмечают температуру, при которой вся жидкость или некоторая ее фракция, объем которой измеряют при температуре 20 °C, отогнаны.

Вносят поправку в наблюдаемую температуру для приведения к нормальному давлению по формуле:

где: t1 - исправленная температура;

t2 - наблюдаемая температура при атмосферном давлении b;

k - поправочный коэффициент в соответствии с таблицей 2.1.2.11.-1, если не указано иного;

b - барометрическое давление во время перегонки, в килопаскалях.

Таблица 2.1.2.11.-1. - Коэффициент поправки для приведения к нормальному давлению

2.1.2.12. Температура кипения

Точкой кипения называют скорректированную температуру, при которой давление паров жидкости равно 101,3 кПа.

Прибор. В данном случае используют тот же прибор, что и для определения пределов перегонки (2.1.2.11.), за исключением того, что термометр вводят в горло колбы таким образом, чтобы нижний конец шарика термометра был на уровне нижнего конца горла перегонной колбы, и чтобы сама колба располагалась на пластине из изолирующего материала со сквозным отверстием диаметром 35 мм.

Методика. 20 мл испытуемой жидкости и несколько кусочков пористого материала помещают в колбу (A). Колбу нагревают таким образом, чтобы быстро достичь кипения, и отмечают температуру, при которой жидкость начинает вытекать из отводной трубки в холодильник.

Вносят поправку в наблюдаемую температуру для приведения к нормальному давлению по формуле:

где: t1 - исправленная температура;

t2 - наблюдаемая температура при атмосферном давлении b;

k - поправочный коэффициент в соответствии с таблицей 2.1.2.11.-1;

b - барометрическое давление во время перегонки, в килопаскалях.

2.1.2.13. Определение воды методом отгонки

Прибор (рисунок 2.1.2.13.-1) состоит из стеклянной круглодонной колбы (A), соединенной трубкой (D) с цилиндрической трубкой (B), снабженной градуированным приемником (E) и обратным холодильником (C). Цена деления приемника (E) 0,1 мл. Для соответствующего нагревания целесообразно использовать электрический нагреватель с реостатом или масляную баню. Верхняя часть колбы и соединительная трубка могут быть покрыты теплоизоляцией.

Рисунок 2.1.2.13.-1. - Прибор для определения воды методом отгонки. Размеры приведены в миллиметрах.

Методика. Приемник и холодильник прибора очищают, промывают водой и высушивают.

200 мл толуола P и около 2 мл воды P помещают в сухую колбу и перегоняют в течение 2 ч. Колбу охлаждают в течение 30 мин и записывают объем воды с точностью до 0,05 мл. В колбу помещают количество вещества, отвешенного с точностью до 1%, которое содержит приблизительно от 2 до 3 мл воды. Если вещество имеет пастоподобную консистенцию, его взвешивают на кусочке металлической фольги. В колбу вносят несколько кусочков пористого материала и осторожно нагревают в течение 15 мин. Когда толуол начнет кипеть, отгоняют со скоростью около двух капель в секунду, пока большая часть воды не отгонится, а затем увеличивают скорость отгонки до четырех капель в секунду.

Когда вода отгонится полностью, внутреннюю трубку холодильника промывают толуолом P. Нагревание продолжают еще 5 мин, затем нагреватель убирают, дают приемнику охладиться до комнатной температуры и стряхивают все капли воды, которые находятся на стенках приемника. После полного разделения воды и толуола записывают объем воды и определяют ее содержание в миллилитрах на килограмм по формуле:

где: m - масса испытуемого образца, в граммах;

n1 - объем воды, определенный при первом отгоне, в миллилитрах;

n2 - общий объем отогнанной воды, определенный в обоих отгонах, в миллилитрах.

2.1.2.14. Температура плавления - капиллярный метод

Температура плавления, определенная капиллярным методом, представляет собой температуру, при которой последняя твердая частичка уплотненного столбика вещества в капиллярной трубке переходит в жидкую фазу.

Если есть указание в частной фармакопейной статье, тот же прибор и методику применяют для определения других показателей, таких, как образование мениска или диапазона плавления, характеризующих поведение вещества при плавлении.

Прибор. Составными частями прибора являются:

- подходящий стеклянный сосуд, содержащий жидкость (например, воду, вазелиновое или силиконовое масло), используемый в качестве бани и оснащенный подходящим устройством для нагрева;

- устройство для перемешивания, обеспечивающее однородную температуру внутри бани;

- термометр с меткой погружения и ценой деления не более 0,5 °C. Разность между верхним и нижним делениями термометра в области измеряемой температуры - не более 100 °C;

- запаянные с одного конца капиллярные трубки из бесщелочного прочного стекла диаметром от 0,9 мм до 1,1 мм и толщиной стенок от 0,10 мм до 0,15 мм.

Методика. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье тонкоизмельченное вещество сушат в вакууме над силикагелем безводным P в течение 24 ч. Достаточное количество вещества помещают в капиллярную трубку до получения уплотненного столбика высотой от 4 мм до 6 мм.

Повышают температуру бани до температуры приблизительно на 10 °C ниже предполагаемой температуры плавления и затем продолжают нагревание со скоростью около 1 °C/мин. Когда температура достигнет значения на 5 °C ниже предполагаемой температуры плавления, помещают капиллярную трубку с веществом в прибор. Для описанного выше прибора капиллярную трубку помещают таким образом, чтобы ее запаянный конец располагался около центра шарика термометра, метка погружения которого находится на уровне поверхности жидкости. Отмечают температуру, при которой последняя твердая частичка переходит в жидкую фазу.

Калибровка прибора. Для калибровки прибора используют подходящие вещества, пригодные для этих целей.

Допускается применение других приборов (например, как указано в статье 2.1.2.42.), использующих капиллярный метод, если показано, что прецизионность и правильность измерений будут не хуже, чем в случае применения прибора, описанного выше.

2.1.2.15. Температура плавления - открытый капиллярный метод

Данный метод используют для определения температуры плавления (также известной как температура сдвига или подъема, либо температура разжижения) некоторых веществ.

Используют стеклянную капиллярную трубку, открытую с обоих концов, длиной около 80 мм, наружным диаметром от 1,4 мм до 1,5 мм и внутренним диаметром от 1,0 мм до 1,2 мм.

Вещество, предварительно обработанное, как указано в частной фармакопейной статье, помещают в каждую из пяти капиллярных трубок в количестве, достаточном для формирования в каждой трубке столбика высотой около 10 мм. Трубки выдерживают определенное время при температуре, указанной в частной фармакопейной статье.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье вещества с воскообразной консистенцией осторожно полностью расплавляют на водяной бане перед заполнением капиллярных трубок. Трубки выдерживают в течение 2 ч при температуре от 2 °C до 8 °C.

Прикрепляют одну из капиллярных трубок к термометру с ценой деления 0,5 °C таким образом, чтобы вещество находилось в непосредственной близости к шарику термометра. Термометр с прикрепленной капиллярной трубкой помещают в стакан так, чтобы расстояние между дном стакана и нижней частью шарика термометра составляло 1 см. Стакан наполняют водой таким образом, чтобы высота слоя составляла 5 см. Повышают температуру воды со скоростью 1 °C/мин.

За температуру плавления принимают температуру, при которой вещество начинает подниматься по капиллярной трубке.

Повторяют эту операцию с четырьмя другими капиллярными трубками и рассчитывают результат как среднее из пяти показаний.

2.1.2.16. Температура плавления - метод мгновенного плавления

Температуру плавления по методу мгновенного плавления рассчитывают по формуле:

где: t1 - первая температура, определяемая в условиях, приведенных ниже;

t2 - вторая температура, определяемая в условиях, приведенных ниже.

Прибор. Прибор состоит из металлического блока, изготовленного из материала, обладающего высокой теплопроводностью и не взаимодействующего с испытуемым веществом, например, из латуни. Верхняя поверхность блока должна быть плоской и тщательно отполированной. Блок равномерно нагревают по всей массе газовой горелкой с микрорегулировкой или электрическим нагревателем с тонкой регулировкой. Блок имеет достаточно широкую цилиндрическую полость для размещения термометра, который должен находиться в одном и том же положении как при калибровке, так и при определении температуры плавления испытуемого вещества. Цилиндрическая полость размещена параллельно отполированной верхней поверхности блока и на расстоянии около 3 мм от нее. Прибор калибруют, используя подходящие вещества с известной температурой плавления.

Методика. Блок быстро нагревают до температуры на 10 °C ниже предполагаемой температуры плавления и затем устанавливают скорость нагревания около 1 °C/мин. Несколько частиц тонко измельченного вещества, высушенного в вакууме над силикагелем безводным P в течение 24 ч, бросают через равные промежутки времени на поверхность блока в непосредственной близости от шарика термометра, очищая поверхность после каждого испытания. Записывают температуру t1, при которой вещество плавится мгновенно при соприкосновении с металлом. Останавливают нагревание. Во время охлаждения через равные временные промежутки бросают несколько частичек вещества на поверхность блока, очищая ее после каждого испытания. Записывают температуру t2, при которой вещество прекращает мгновенно плавиться при соприкосновении с металлом.

Калибровка прибора. Для калибровки прибора используют подходящие вещества, пригодные для этих целей.

2.1.2.17. Температура затвердевания

Температура затвердевания представляет собой максимальную температуру, при которой происходит затвердевание переохлажденной жидкости.

Прибор. Прибор (рисунок 2.1.2.17.-1) состоит из пробирки для проведения определения диаметром около 25 мм и длиной около 150 мм, помещенной вовнутрь другой пробирки диаметром около 40 мм и длиной около 160 мм. Внутренняя пробирка закрыта пробкой, снабженной термометром длиной около 175 мм с ценой деления 0,2 °C, который закреплен таким образом, чтобы ртутный шарик находился на уровне около 15 мм от дна пробирки. В пробке имеется отверстие, через которое проходит вал мешалки, изготовленный из стеклянного стержня или другого подходящего материала, загнутый на конце под прямым углом в виде петли, внешний диаметр которой около 18 мм. Внутреннюю пробирку вместе с внешней пробиркой размещают в центре сосуда вместимостью 1 л, в который помещают подходящую охлаждающую жидкость, уровень которой находится в пределах не ниже 20 мм от верхнего края сосуда. Охлаждающая баня также должна быть снабжена термометром.

Рисунок 2.1.2.17.-1. - Прибор для определения температуры затвердевания. Размеры приведены в миллиметрах.

Методика. Во внутреннюю пробирку помещают достаточное количество жидкости или предварительно расплавленного вещества, чтобы покрыть ртутный шарик термометра (ртутный шарик термометра должен находиться посередине слоя испытуемого вещества), и при быстром охлаждении определяют приблизительную температуру затвердевания. Внутреннюю пробирку помещают в водяную баню с температурой на 5 °C выше приблизительно определенной температуры до полного расплавления кристаллов. Затем заполняют сосуд водой или насыщенным раствором натрия хлорида с температурой на 5 °C ниже ожидаемой температуры затвердевания. Внутреннюю пробирку вместе с внешней помещают в сосуд, убеждаются в наличии центров кристаллизации и тщательно перемешивают испытуемый образец в течение затвердевания. Отмечают наиболее высокую температуру, наблюдаемую во время затвердевания.

2.1.2.18. Амперометрическое титрование

Амперометрическое титрование является методом количественного анализа, при котором конечная точка титрования определяется по изменению тока между погруженными в анализируемый раствор электродами в зависимости от количества прибавляемого титранта. Один из электродов - индикаторный, второй - электрод сравнения, обладающий постоянным потенциалом. Напряжение, накладываемое на электроды, должно быть таким, чтобы потенциал индикаторного электрода обеспечивал предельный диффузионный ток, обусловленный разрядом электрохимически активных соединений, участвующих в титриметрической реакции.

Разновидностью метода является использование пары идентичных индикаторных электродов небольшой поверхности (обычно платиновые или золотые), находящихся под напряжением, достаточным для протекания катодного и анодного процессов при наличии в растворе окислительно-восстановительной пары. Это вид титрования рекомендуется при йодометрическом и нитритометрическом определении, а также при определении воды по методу К. Фишера.

Оборудование. Прибор для амперометрического титрования состоит из источника постоянного тока с регулируемым напряжением, микроамперметра и электродной пары. В качестве индикаторного электрода обычно используют инертные электроды - платиновый, золотой, ртутный капельный, графитовый или стеклоуглеродный, а также сделанный из этих материалов вращающийся дисковый электрод. В качестве электрода сравнения обычно используют каломельный или хлорсеребряный электрод.

При титровании в средах с большим сопротивлением может использоваться трехэлектродная схема. Напряжение накладывается на индикаторный и вспомогательный электроды, а требуемый потенциал индикаторного электрода устанавливается относительно электрода сравнения.

Методика. При амперометрическом титровании устанавливают потенциал индикаторного электрода, обеспечивающий протекание электрохимической реакции, и регистрируют величину тока в зависимости от количества прибавленного титранта. Титрование продолжают после достижения предполагаемой точки эквивалентности. По меньшей мере, три точки с двух сторон от точки эквивалентности должны лежать на прямой. Конечная точка титрования является точкой пересечения двух прямых.

При амперометрическом титровании с двумя индикаторными электродами регистрируют всю кривую титрования и используют для определения конечной точки титрования.

Перечень параметров, указываемых в частных фармакопейных статьях. Конкретные параметры - тип индикаторного электрода, потенциал индикаторного электрода (или разность потенциалов двух индикаторных электродов), электрод сравнения, массу анализируемого вещества, тип и концентрацию титранта - указывают в частных фармакопейных статьях.

2.1.2.19. Потенциометрическое титрование

При потенциометрическом титровании (объемном титровании с потенциометрическим определением конечной точки) конечную точку определяют путем регистрации изменения потенциала между 2 электродами (либо 1 индикаторный электрод и 1 электрод сравнения, либо комбинированный электрод), погруженными в испытуемый раствор, как функции добавленного объема титранта.

Прибор. Прибор представляет собой милливольтметр. Могут быть использованы коммерчески доступные автоматические титраторы, эксплуатируемые в соответствии с инструкциями заводов-изготовителей, с использованием электродов, рекомендуемых для описываемого типа титрования.

В зависимости от природы определяемого вещества подбирают подходящий индикаторный электрод, который может быть стеклянным или металлическим (например, платиновым, золотым или серебряным).

Для кислотно-основных титрований обычно используют комбинированные стеклянные электроды.

Метод. Раствор образца готовят, как указано в частной фармакопейной статье. Добавляют подходящие аликвоты титранта, уделяя особое внимание скорости добавления и величине шага около конечной точки. Титрование продолжают сверх предполагаемой конечной точки для ее четкого определения.

Конечная точка титрования соответствует максимальному изменению потенциала на графике зависимости значения потенциала от объема титранта, и выражается как соответствующий объем титранта. Определению конечной точки может способствовать регистрация первой или второй производной.

При потенциометрическом титровании слабой кислоты или основания с использованием неводных растворителей при необходимости проводят либо контрольный опыт, либо предварительно нейтрализуют смесь растворителей. В случае если использование для этих целей потенциометрического детектирования не целесообразно, смесь растворителей может быть предварительно нейтрализована путем титрования с использованием подходящего индикатора. Некоторые примеры приведены в таблице 2.1.2.19.-1.

Таблица 2.1.2.19.-1. - Индикаторы, подходящие для нейтрализации смеси растворителей

2.1.2.20. Флуориметрия

Флуориметрия - метод анализа, основанный на измерении интенсивности флуоресценции, излучаемой испытуемым веществом, относительно флуоресценции, излучаемой стандартным образцом.

Метод. Испытуемое вещество растворяют в растворителе или смеси растворителей, указанных в частной фармакопейной статье. Полученный раствор помещают в кювету или камеру флуориметра и облучают возбуждающим светом, имеющим как можно большую монохроматичность, при длине волны, указанной в частной фармакопейной статье.

Измеряют интенсивность испускаемого света под углом 90° относительно возбуждающего света после прохождения сквозь фильтр, избирательно пропускающий свет с длиной волны максимальной флуоресценции. Могут быть использованы и другие типы приборов при условии получения аналогичных результатов.

При проведении количественных определений в прибор помещают растворитель или смесь растворителей, используемые для растворения испытуемого вещества, и устанавливают регистрирующее устройство прибора на нулевое значение. Затем помещают стандартный раствор и устанавливают чувствительность прибора таким образом, чтобы отклик показаний был больше 50. Если другое регулирование было проведено с изменением ширины щели, повторно устанавливают регистрирующее устройство прибора на нулевое значение и снова измеряют интенсивность флуоресценции стандартного раствора. Затем в прибор помещают испытуемый раствор с неизвестной концентрацией и регистрируют показания прибора. Концентрацию (cx) испытуемого вещества в растворе рассчитывают по формуле:

где: cx - концентрация испытуемого раствора;

cs - концентрация стандартного раствора;

Ix - интенсивность флуоресценции испытуемого раствора;

Is - интенсивность флуоресценции стандартного раствора.

Если значения интенсивности флуоресценции не строго пропорциональны значениям концентрации растворов, измерения могут проводиться с использованием калибровочного графика.

В некоторых случаях измерения могут проводиться с использованием фиксированного стандарта (например, флуоресцирующего стекла или раствора флуоресцирующей жидкости). В таких случаях концентрация испытуемого вещества может определяться с использованием калибровочного графика, построенного в тех же условиях.

2.1.2.21. Атомно-эмиссионная спектрометрия

ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП

Атомная эмиссия - процесс испускания электромагнитного излучения возбужденными атомами или ионами. В атомно-эмиссионной спектрометрии испытуемый образец подвергается воздействию достаточно высоких температур, вызывающих как диссоциацию на атомы, так и значительное количество соударений, приводящих к возбуждению и ионизации атомов испытуемого образца. Атомы и ионы, будучи в возбужденном состоянии, способны возвращаться в основное энергетическое состояние с передачей тепловой или излучающей энергии и испусканием (эмиссией) электромагнитного излучения. Эмиссионный спектр элемента содержит несколько больше линий, чем соответствующий абсорбционный спектр.

Атомно-эмиссионная спектрометрия - метод определения содержания химического элемента в испытуемом образце посредством измерения интенсивности одной из эмиссионных линий атомного пара элемента. Определение проводят при длине волны, соответствующей выбранной эмиссионной линии.

В данной общей фармакопейной статье рассматривается только пламенная атомизация. Метод атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (АЭС-ИСП) описан в другой общей фармакопейной статье.

ПРИБОР

Главными составляющими частями прибора являются:

- система введения и распыления образца;

- пламенный генератор атомного пара;

- монохроматор;

- детектор;

- блок сбора данных.

Для получения пламени могут быть использованы водород, ацетилен, пропан или бутан в сочетании с кислородом или воздухом. Выбор генератора атомного пара является критическим моментом, так как он должен обеспечивать достаточную энергию для возбуждения и распыления атомов. Атомные спектры, полученные с использованием пламенного генератора атомного пара, имеют преимущества, будучи более простыми, по сравнению со спектрами, полученными с использованием генераторов атомного пара других типов, однако основным лимитирующим фактором в его использовании является недостаточная мощность для возбуждения атомов многих элементов. Предпочтительным растворителем для приготовления испытуемых растворов и растворов сравнения является подкисленная вода, но могут быть использованы и органические растворители, если доказано, что они не влияют на стабильность пламени.

ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

Спектральную интерференцию уменьшают или исключают путем выбора для измерения подходящей линии спектра либо подбора ширины щели. Физическую интерференцию корректируют разведением раствора испытуемого образца, подбором матрицы или использованием метода стандартных добавок. Химическую интерференцию уменьшают использованием химических модификаторов или ионизационных буферов.

ЭФФЕКТ ПАМЯТИ

Влияние эффекта памяти, обусловленного осаждением определяемого элемента в приборе, может быть снижено тщательным промыванием прибора между испытаниями, разведением, если это возможно, измеряемых растворов, снижающим таким образом содержание соли, и по возможности быстрым впрыскиванием растворов.

МЕТОД

Определения проводят путем сравнения со стандартными растворами с известными концентрациями определяемого элемента методом калибровочного графика (метод I) или методом стандартных добавок (метод II).

Атомно-эмиссионный спектрометр выводят на режим в соответствии с инструкцией завода-производителя и устанавливают необходимую длину волны. Устанавливают параметры эксперимента (температура пламени, настройка горелки, использование ионного буфера, концентрация растворов), необходимые для определения анализируемого элемента, учитывая матрицу образца. В генератор атомного пара вводят контрольный раствор и настраивают регистрирующее устройство на нулевое значение или на значение контрольного опыта. Вводят раствор сравнения определяемого элемента с наибольшей концентрацией и настраивают прибор так, чтобы получить регистрируемый сигнал в оптимальном диапазоне измерений.

Предпочтительно, чтобы концентрации растворов находились в линейной части калибровочного графика. Если это невозможно, могут быть использованы криволинейные калибровочные графики с применением подходящего программного обеспечения.

На всех этапах проведения испытания рекомендуется по возможности использовать полимерную лабораторную посуду.

МЕТОД I - МЕТОД КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА

Обычно для измерений готовят и используют три раствора сравнения определяемого элемента и контрольный раствор.

Раствор испытуемого образца (испытуемый раствор) готовят, как указано в частной фармакопейной статье. Не менее трех растворов сравнения определяемого элемента готовят так, чтобы диапазон концентраций этих растворов включал ожидаемое значение концентрации определяемого элемента в испытуемом растворе. Для количественного анализа оптимальные значения калибровки должны находиться в диапазоне от 0,7 до 1,3 от ожидаемого содержания определяемого элемента или от предела, указанного в частной фармакопейной статье. Для анализа на содержание примесей оптимальные значения калибровки должны находиться в диапазоне от предела обнаружения до 1,2 от предельного значения для определяемого элемента. Любые реактивы, используемые при приготовлении испытуемого раствора, прибавляют в контрольный раствор и растворы сравнения в таких же количествах, как и в испытуемый раствор.

Вводят растворы, используя одинаковое количество повторов для получения устойчивых результатов.

Расчет. Строят калибровочную кривую зависимости средних значений эмиссии растворов сравнения от концентрации, по которой определяют концентрацию элемента в испытуемом растворе.

МЕТОД II - МЕТОД СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК

Раствор испытуемого образца (испытуемый раствор) готовят, как указано в частной фармакопейной статье. Равные объемы испытуемого раствора помещают не менее чем в три мерные колбы одинакового объема. Во все мерные колбы кроме одной прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы раствора сравнения с известной концентрацией определяемого элемента, получая серию растворов, содержащих устойчиво возрастающие концентрации элемента, значения эмиссии которого, если это возможно, находятся в линейной области калибровочного графика. Доводят содержимое каждой колбы растворителем до метки.

Вводят растворы, используя одинаковое количество повторов для получения устойчивых результатов.

Расчет. Методом наименьших квадратов рассчитывают линейное уравнение графика и по нему - концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

Через определенные временные интервалы верифицируют удовлетворительное исполнение методики, описанной в частной фармакопейной статье.

ЛИНЕЙНОСТЬ

Готовят и анализируют не менее четырех растворов сравнения, концентрация которых находится в пределах диапазона калибровки, и контрольный раствор. Проводят не менее пяти измерений.

Используя все полученные данные, рассчитывают калибровочную кривую методом наименьших квадратов. Строят кривую регрессии, отмечая средние значения, измеренные значения и доверительный интервал калибровочного графика. Метод является пригодным при условии соблюдения следующих требований:

- коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99;

- на калибровочном графике погрешности каждого калибровочного уровня должны быть распределены случайным образом.

Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня.

В случае если отношение рассчитанного стандартного отклонения наименьшего и наибольшего калибровочного уровня менее 0,5 или более 2,0, то более точная оценка калибровочного графика может быть получена с использованием взвешенной линейной регрессии. Линейная и квадратичная весовая функции применяются к полученным данным для нахождения наиболее подходящей для использования весовой функции. Если средние значения при сравнении с калибровочным графиком проявляют отклонение от линейности, используют двухмерную линейную регрессию.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Предпочтительно верифицировать правильность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываемость.

Открываемость. В случае методик количественного определения открываемость должна быть от 90% до 110%. Для других определений, например для определения следовых количеств элемента, открываемость должна быть от 80% до 120% от теоретического значения. Открываемость может быть определена с использованием подходящего раствора сравнения (матриксного раствора), содержащего известное количество определяемого элемента (средняя концентрация калибровочного графика).

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Повторяемость должна быть не более 3% для количественного определения и не более 5% для испытания на содержание примесей.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Удостоверяются, что предел количественного определения (например, определенный с использованием приближения ) ниже измеряемого значения.

2.1.2.22. Атомно-абсорбционная спектрометрия

ОСНОВНОЙ ПРИНЦИП

Атомная абсорбция - процесс поглощения электромагнитного излучения специфической длины волны атомом в основном состоянии с переходом в возбужденное состояние. Атомы в основном состоянии поглощают энергию с резонансной частотой, и вследствие такого резонансного поглощения электромагнитное излучение ослабляется. Поглощенная энергия фактически прямо пропорциональна количеству присутствующих атомов.

Данная общая фармакопейная статья приводит общую информацию и определяет порядок действия при определении элементов атомноабсорбционной спектрометрией либо с помощью атомизации с использованием пламени, электротермического испарения в графитовой печи, получения гидридов, либо способом холодного пара для определения ртути.

Атомно-абсорбционная спектрометрия - техника определения концентрации элемента в испытуемом образце путем измерения поглощения электромагнитного излучения атомным паром элемента испытуемого образца. Испытание проводят при длине волны одной из линий поглощения (резонансных линий) определяемого элемента. Количество поглощенного излучения, в соответствии с законом Бугера - Ламберта - Бера, пропорционально концентрации элемента.

ПРИБОР

Основными составляющими частями прибора являются:

- источник излучения;

- система введения и распыления образца;

- атомизатор;

- монохроматор или полихроматор;

- детектор;

- блок сбора данных.

Прибор обычно оснащают системой коррекции фона. В качестве источника излучения используют лампы с полым катодом (ЛПК, HCL - hollow-cathodelamp) и безэлектродные газоразрядные лампы (БЭГЛ, EDL - electrodeless-dischargelamp). Излучение таких ламп имеет спектр определяемого элемента, состоящий из очень узких линий с полушириной около 0,002 нм.

Существует три типа атомизаторов:

- Пламенный способ

Пламенный атомизатор состоит из системы распыления с пневматическим приспособлением для получения аэрозоля, регулятора газа и горелки. Для получения температуры от 2000 К до 3000 К используют различные смеси горючего газа (пропан, водород и ацетилен) и окислителя (воздух и оксид азота). Конфигурацию горелки адаптируют под используемые газы, скорость подачи газа регулируется. Образцы распыляют, используя подкисленную воду как предпочтительный растворитель для приготовления испытуемых растворов и растворов сравнения. Могут быть использованы и органические растворители, если гарантировано, что они не влияют на стабильность пламени.

- Способ электротермической атомизации

Основными составляющими электротермического атомизатора являются графитовая трубчатая печь и источник электроэнергии. При использовании графитовой трубчатой печи происходит полная атомизация образца и атомный пар удерживается на пути излучения в течение длительного времени, что улучшает предел определения. Образцы (жидкости и твердые вещества) вводят непосредственно в графитовую трубчатую печь, которая нагревается постепенно по заданной программе, сначала высушивая образец, затем удаляя основные компоненты матрикса путем пиролиза, после чего атомизируя весь определяемый элемент. Очищают печь, нагревая ее до температуры более высокой, чем температура атомизации. Продувание графитовой печи инертным газом во время пиролиза приводит к более качественному процессу атомизации.

- Способ холодного пара и гидридный метод

Атомный пар может быть получен и вне спектрометра. Такой способ получения атомного пара используют в методе холодного пара при определении ртути или для определения таких элементов, образующих гидриды, как мышьяк, сурьма, висмут, селен и олово. В случае определения ртути, атомы генерируют химическим восстановлением с помощью олова хлорида или натрия натрия, после чего атомный пар быстро переносят с помощью инертного газа в холодную кварцевую кювету, расположенную на пути излучения, испускаемого лампой. Гидриды, генерированные таким образом, переносятся с помощью инертного газа в горячую кювету, где они диссоциируют на атомы.

ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

При измерениях атомной абсорбции могут иметь место химическая, физическая, ионизационная и спектральная интерференции. Химическую интерференцию компенсируют использованием модификаторов матрикса или высвобождающих агентов, либо использованием высоких температур пламени азота оксида - ацетилен. Ионизационную интерференцию компенсируют использованием специальных ионизационных буферов (например, лантановых или цезиевых). Физическую интерференцию, обусловленную высоким содержанием соли или вязкостью, компенсируют, используя разведение образца, посредством метода стандартных добавок или подбором матрикса. Спектральная интерференция происходит при перекрывании резонансных линий, и для ее исключения используют другую резонансную линию. Использование коррекции фона Зеемана также компенсирует спектральную интерференцию и помехи, связанные с поглощением излучения молекулами, особенно при использовании способа электротермической атомизации. Также к спектральной интерференции может приводить использование многоэлементных ламп с полым катодом. Специфическое или неспецифическое поглощение измеряют в спектральном диапазоне, определяемом выбранной шириной щели монохроматора (0,2 - 2 нм).

КОРРЕКЦИЯ ФОНА

Рассеивание и фон увеличивают значение измеряемого поглощения при атомизации пламенем или при электротермической атомизации. Поглощение фоном охватывает широкий диапазон длин волн, в то время как атомы поглощают в очень узких диапазонах порядка 0,005 - 0,02 нм. Поглощение фоном может быть скорректировано использованием контрольного раствора, имеющего точно такой же состав, что и раствор образца, за исключением определяемого элемента, что, однако, часто является неосуществимым. При электротермической атомизации температура пиролиза должна быть подобрана так, чтобы исключить продукты разложения матрикса, вызывающие фоновое поглощение. Коррекция фона может быть проведена также с использованием двух различных источников энергии: лампы с полым катодом, с помощью которой измеряют общее поглощение (элемент + фон), и дейтериевой лампы с непрерывной эмиссией, с помощью которой измеряют фоновое поглощение. Для коррекции фона сигнал, полученный от дейтериевой лампы, вычитают из сигнала, полученного от лампы с полым катодом. Этот способ лимитирован спектральным диапазоном дейтериевой лампы (от 190 нм до 400 нм). Фоновое поглощение также может быть найдено путем измерения поглощения при двух длинах волн: резонансной линии и длине волны, близкой к резонансной, но при которой не наблюдается поглощения образцом, и последующим вычитанием из поглощения резонансной линии поглощения второй длины волны.

Еще один способ коррекции фона - эффект Зеемана (основан на расщеплении Зеемана линии поглощения в магнитном поле). Данный способ особенно полезен в случае, если фон имеет тонкую структуру, а также позволяет значительно скорректировать фон в диапазоне от 185 нм до 900 нм.

ВЫБОР УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЯ

После подбора подходящей длины волны и ширины щели для определяемого элемента рассматривают следующие моменты:

- коррекцию неспецифического фонового поглощения;

- необходимость прибавления химических модификаторов или ионизационных буферов к образцу, а также к контрольному раствору и растворам сравнения;

- разведение образца (например, для минимизации физической интерференции);

- детали температурной программы, предварительный нагрев, высушивание, пиролиз, атомизацию, постатомизацию со временем линейного нарастания и временем удерживания;

- расход инертного газа;

- модификаторы матрикса для электротермической атомизации (печь);

- химические восстанавливающие реагенты для определений ртути или других гидридобразующих элементов вместе с температурой кюветы с холодным паром или температуры нагреваемой кюветы;

- технические требования по исполнению печи (камера, платформа Львова и другие).

МЕТОД

Определения проводят путем сравнения со стандартными растворами с известными концентрациями определяемого элемента методом калибровочного графика (метод I), или методом стандартных добавок (метод II).

Атомно-абсорбционный спектрометр выводят на режим в соответствии с инструкцией завода-производителя и устанавливают необходимую длину волны. В генератор атомного пара вводят контрольный раствор и настраивают регистрирующее устройство на максимум пропускания. Значение для контрольного раствора может быть определено путем использования растворителя для установки прибора на нулевое значение. Вводят раствор сравнения определяемого элемента с наибольшей концентрацией и настраивают прибор так, чтобы получить максимальный регистрируемый сигнал. Во избежание загрязнения и эффекта памяти тщательно промывают прибор. После завершения анализа прибор промывают водой P или подкисленной водой.

В случае использования техники ввода твердых проб, все условия проведения испытания описывают в частной фармакопейной статье.

Предпочтительно, чтобы концентрации растворов находились в линейной части калибровочного графика. Если это невозможно, могут быть использованы криволинейные калибровочные графики с применением подходящего программного обеспечения.

На всех этапах проведения испытания рекомендуется по возможности использовать полимерную лабораторную посуду. Для подготовки образца может потребоваться растворение, разложение (как правило, в микроволновой печи), озоление или сочетание указанных операций для того, чтобы очистить матрикс образца и/или удалить углеродсодержащие вещества. Если процесс происходит в открытой системе, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, температура прокаливания не должна превышать 600 °C по причине летучести некоторых металлов.

МЕТОД I - МЕТОД КАЛИБРОВОЧНОГО ГРАФИКА

Обычно для измерений готовят и используют три раствора сравнения определяемого элемента и контрольный раствор.

Испытуемый раствор готовят, как указано в частной фармакопейной статье. Не менее трех растворов сравнения определяемого элемента готовят так, чтобы диапазон концентраций этих растворов включал ожидаемое значение концентрации определяемого элемента в испытуемом растворе. Для количественного анализа оптимальные значения калибровки должны находиться в диапазоне от 0,7 до 1,3 от ожидаемого содержания определяемого элемента или от предела, указанного в частной фармакопейной статье. Для анализа на содержание примесей оптимальные значения калибровки должны находиться в диапазоне от предела обнаружения до 1,2 от предельного значения для определяемого элемента. Любые реактивы, используемые при приготовлении испытуемого раствора, прибавляют в контрольный раствор и растворы сравнения в таких же количествах, как и в испытуемый раствор.

Вводят растворы, используя одинаковое количество повторов для получения устойчивых результатов.

Расчет. Строят калибровочную кривую зависимости средних значений поглощения растворов сравнения от концентрации, по которой определяют концентрацию элемента в испытуемом растворе.

МЕТОД II - МЕТОД СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК

Испытуемый раствор готовят, как указано в частной фармакопейной статье. Равные объемы испытуемого раствора помещают не менее, чем в три мерные колбы одинакового объема. Во все мерные колбы кроме одной прибавляют пропорционально увеличивающиеся объемы раствора сравнения с известной концентрацией определяемого элемента, получая серию растворов, содержащих устойчиво возрастающие концентрации определяемого элемента, получая, если это возможно, значения в линейной области кривой. Доводят содержимое каждой колбы растворителем до метки.

Вводят растворы, используя одинаковое количество повторов для получения устойчивых результатов.

Расчет. Методом наименьших квадратов находят линейное уравнение графика и по нему рассчитывают концентрацию определяемого элемента в испытуемом растворе.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

Через определенные временные интервалы верифицируют удовлетворительное исполнение методики, описанной в частной фармакопейной статье.

ЛИНЕЙНОСТЬ

Готовят и анализируют не менее четырех растворов сравнения, концентрация которых находится в пределах диапазона калибровки, и контрольный раствор. Проводят не менее пяти измерений.

Используя все полученные данные, рассчитывают калибровочную кривую методом наименьших квадратов. Строят кривую регрессии, отмечая средние значения, измеренные значения и доверительный интервал калибровочного графика. Метод является пригодным при условии соблюдения следующих требований:

- коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99;

- на калибровочном графике погрешности каждого калибровочного уровня должны быть распределены случайным образом.

Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня.

В случае если отношение рассчитанного стандартного отклонения наименьшего и наибольшего калибровочного уровня менее 0,5 или более 2,0, может быть получена более точная оценка калибровочного графика с использованием взвешенной линейной регрессии. И линейная, и квадратичная весовая функции применяются к полученным данным для нахождения наиболее подходящей для использования весовой функции. Если средние значения при сравнении с калибровочным графиком проявляют отклонение от линейности, используют двухмерную линейную регрессию.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Предпочтительно верифицировать правильность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываемость.

Открываемость. В случае методик количественного определения открываемость должна быть от 90% до 110%. Для других определений, например для определения следовых количеств элемента, открываемость должна быть от 80% до 120% от теоретического значения. Открываемость может быть определена с использованием подходящего раствора сравнения (матриксного раствора), содержащего известное количество определяемого элемента (средняя концентрация калибровочного графика).

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Повторяемость должна быть не более 3% для количественного определения и не более 5% для испытания на содержание примесей.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Удостоверяются, что предел количественного определения (например, определенный с использованием приближения 10) ниже измеряемого значения.

2.1.2.23. Абсорбционная спектрофотометрия в инфракрасной области

Инфракрасные спектрофотометры применяют для записи спектров в области от 4000 см-1 до 650 см-1 (от 2,5 мкм до 15,4 мкм), а в некоторых случаях до 200 см-1 (до 50 мкм).

ПРИБОР

Спектрофотометры для записи спектров состоят из подходящего источника излучения, монохроматора или интерферометра и детектора.

В спектрофотометрах с Фурье-преобразованием используется полихроматическое излучение и рассчитывается спектр в заданной области частот путем Фурье-преобразования исходных данных. Также могут быть использованы спектрофотометры, снабженные оптической системой, способной выделять монохроматическое излучение в измеряемой области. Обычно спектр представляется как функция пропускания, т.е. отношения интенсивности прошедшего к падающему на образец излучению. Но также может быть представлен как функция поглощения.

Оптическую плотность (A) определяют как десятичный логарифм обратной величины пропускания (T):

где: 

I0 - интенсивность излучения, падающего на вещество;

I - интенсивность излучения, прошедшего через вещество.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ ПРОПУСКАНИЯ ИЛИ ПОГЛОЩЕНИЯ

Испытуемый образец готовят по одной из следующих методик.

Жидкости. Жидкости исследуют в форме пленки, находящейся между двумя пластинками, прозрачными для инфракрасного излучения, или в кювете с соответствующей толщиной слоя, также прозрачной для инфракрасного излучения.

Жидкости или твердые вещества в растворе. Готовят раствор испытуемого образца в подходящем растворителе. Выбирают концентрацию вещества и толщину слоя кюветы, позволяющие получить удовлетворительный спектр. Обычно хорошие результаты получают при концентрациях от 10 г/л до 100 г/л и толщине слоя от 0,5 мм до 0,1 мм. Поглощение растворителя компенсируют путем помещения в канал сравнения аналогичной кюветы, содержащей выбранный растворитель. При использовании прибора с Фурье-преобразованием записывают поочередно спектр растворителя и спектр образца, и вычитают поглощение растворителя с учетом коэффициента компенсации.

Твердые вещества. Твердые вещества исследуют в виде суспензий, полученных путем диспергирования в подходящей жидкости, или в твердом состоянии (диски из галогенидов). Если указано в частной фармакопейной статье, формируют пленку из расплавленной массы между двумя пластинами, прозрачными для инфракрасного излучения.

а) Суспензия. Небольшое количество испытуемого вещества растирают с минимальным количеством вазелинового масла P или другой подходящей жидкости; обычно от 5 мг до 10 мг испытуемого вещества достаточно для получения подходящей суспензии с использованием одной капли вазелинового масла P. Полученную суспензию сжимают между двумя пластинками, прозрачными для инфракрасного излучения.

б) Диски. От 1 мг до 2 мг испытуемого вещества растирают с 300 - 400 мг, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, тщательно измельченного и высушенного калия бромида P или калия хлорида P. Обычно этих количеств достаточно для получения диска диаметром 10 - 15 мм и спектра соответствующей интенсивности. Если вещество является гидрохлоридом, рекомендуют использовать калия хлорид P. Смесь тщательно растирают, помещают равномерно в пуансон и прессуют при давлении около 800 МПа (8 т·см-2). Диски из нестабильных при обычных атмосферных условиях или гигроскопичных веществ прессуют в вакууме. Причиной образования некачественных дисков могут быть такие факторы, как недостаточное или чрезмерное растирание, влажность или иные примеси в дисперсионной среде и недостаточное измельчение частиц. Диск непригоден для испытания, если он при визуальном осмотре неоднороден по прозрачности или пропускание при 2000 см-1 (5 мкм) составляет менее 60% без компенсации при отсутствии специфической полосы поглощения вещества.

Газы. Газы исследуют в кювете, прозрачной для инфракрасного излучения, с длиной оптического пути около 100 мм. Из кюветы откачивают воздух и заполняют ее необходимым газом до требуемого давления через кран или при помощи игольчатого клапана через подходящую газовую линию между кюветой и контейнером с веществом, предназначенным для испытания.

При необходимости, давление в кювете доводят до атмосферного, используя газ, прозрачный для инфракрасного излучения (например, азот P или аргон P). Мешающее влияние поглощения воды, углерода диоксида или других атмосферных газов исключают путем помещения в канал сравнения идентичной кюветы, которая либо вакуумирована, либо заполнена газом, прозрачным для инфракрасного излучения.

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ ДИФФУЗНОГО ОТРАЖЕНИЯ

Твердые вещества. Смесь испытуемого вещества с тонко измельченным и высушенным калия бромидом P или калия хлоридом P растирают в порошок. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, готовят смесь, содержащую около 5% вещества. Смесь растирают, помещают в чашку для образца и записывают спектр отражения.

После математической обработки записанного спектра по функции Кубелка - Мунка может быть получен спектр поглощения вещества.

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕКТРОВ НАРУШЕННОГО ПОЛНОГО ВНУТРЕННЕГО ОТРАЖЕНИЯ

Нарушенное полное отражение (включая многократное отражение) касается света, обычно многократно внутренне отраженного пропускающей средой. Существуют приборы, где происходит только одно отражение. Испытуемое вещество помещают на внутренний отражающий элемент (ВОЭ, IRE), например, из алмаза, германия, цинка селенида, таллия бромида - таллия йодида (KRS-5) или из другого подходящего вещества с высоким показателем преломления, и добиваются плотного и однородного контакта со всей поверхностью кристалла внутреннего отражающего элемента с помощью давления или растворяя вещество в подходящем растворителе и высушивая полученный раствор на внутреннем отражающем элементе. Просматривают спектр нарушенного полного внутреннего отражения (НПВО, ATR).

ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ

Образцы испытуемого вещества и стандартного образца готовят по одной и той же методике и записывают спектры в области от 4000 см-1 до 650 см-1 (от 2,5 мкм до 15,4 мкм) в одних и тех же условиях. Минимумы пропускания (максимумы поглощения) в спектрах испытуемого вещества должны соответствовать по положению и относительной величине таковым в спектре стандартного образца.

Если спектры, полученные в твердом состоянии, отличаются по положению минимумов пропускания (максимумов поглощения), то испытуемое вещество и стандартный образец обрабатывают одним и тем же способом так, чтобы они кристаллизовались или получались в одной и той же форме, или обрабатывают способом, указанным в частной фармакопейной статье, а затем снимают спектры.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНЫХ СПЕКТРОВ

Контроль разрешающей способности. В случае приборов с монохроматором записывают спектр пленки полистирола толщиной около 35 мкм. Разность x (см. рисунок 2.1.2.23.-1) между процентом пропускания в максимуме пропускания A при 2870 см-1 (3,48 мкм) и минимуме пропускания B при 2849,5 см-1 (3,51 мкм) должна быть более 18. Разность y между процентом пропускания в максимуме пропускания C при 1589 см-1 (6,29 мкм) и минимуме пропускания D при 1583 см-1 (6,32 мкм) должна быть более 10.

Рисунок 2.1.2.23.-1.

В случае приборов с Фурье-преобразованием устанавливают подходящее разрешение с соответствующей аподизацией, рекомендуемое производителем. Для контроля разрешающей способности используют подходящие методы, например, записывают спектр пленки полистирола толщиной около 35 мкм. Разность между поглощением в минимуме поглощения при 2870 см-1 и максимуме поглощения при 2849,5 см-1 должна быть более 0,33. Разность между поглощением в минимуме поглощения при 1589 см-1 и максимуме поглощения при 1583 см-1 должна быть более 0,08.

Типичный спектр полистирола, используемого для проверки разрешающей способности.

Проверка шкалы волновых чисел. Шкала волновых чисел может быть проверена с использованием пленки полистирола, которая имеет минимум пропускания (максимум поглощения) при волновых числах (см-1), приведенных в таблице 2.1.2.23.-1.

Таблица 2.1.2.23.-1. - Минимумы пропускания и допустимые отклонения для пленки полистирола

Методика. Испытуемое вещество готовят к испытанию согласно инструкции, приложенной к стандартному спектру/стандартному образцу. Используя условия, при которых проводилась проверка разрешающей способности и получен стандартный спектр, записывают спектр испытуемого вещества.

Положения и относительные величины полос в спектре испытуемого вещества и стандартном спектре должны согласовываться между собой.

Компенсация влияния паров воды и атмосферного углерода диоксида. При использовании приборов с Фурье-преобразованием спектральная интерференция, вызываемая парами воды и диоксидом углерода, компенсируется с использованием подходящих алгоритмов в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, спектры могут быть получены либо на приборах, очищенных соответствующим образом, либо при абсолютно одинаковых условиях записи однолучевого спектра фона и спектра образца.

ПРИМЕСИ В ГАЗАХ

Для анализа примесей используют кювету, прозрачную для инфракрасного излучения и имеющую соответствующую длину оптического пути (например, от 1 м до 20 м). Кювету заполняют так, как указано в разделе "Газы". Для определения и количественной оценки примесей используют методики, указанные в частных фармакопейных статьях.

2.1.2.24. Абсорбционная спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях

Определение оптической плотности. Оптическая плотность (A) раствора представляет собой десятичный логарифм обратной величины пропускания (T) для монохроматического излучения и выражается соотношением:

где: 

I0 - интенсивность падающего монохроматического излучения;

I - интенсивность прошедшего монохроматического излучения.

В отсутствие других физико-химических факторов измеренная оптическая плотность (A) пропорциональна длине пути (b), через который проходит излучение, и концентрации (c) вещества в растворе в соответствии с уравнением:

где: - молярный коэффициент поглощения;

b - длина оптического пути, в сантиметрах;

c - концентрация вещества в растворе, в моль на литр.

Величина представляет собой удельный показатель поглощения, то есть оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 г/л в кювете с толщиной слоя 1 см:

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кюветы 1 см. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье измерение проводят по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. Оптическая плотность растворителя, измеренная против воздуха при указанной длине волны, не должна превышать 0,4 и желательно, чтобы она была менее 0,2. Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция от длины волны - по оси абсцисс.

Если в частной фармакопейной статье приводят только одно значение для положения максимума поглощения, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на +/- 2 нм.

Прибор. Спектрофотометры, предназначенные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптической системы, выделяющей монохроматическое излучение в области от 200 нм до 800 нм, и устройства для измерения оптической плотности.

Проверка шкалы длин волн. Для проверки шкалы длин волн используют линии водородной или дейтериевой разрядной лампы или линии паров ртути, а также максимумы поглощения гольмия перхлората раствор P, которые представлены в таблице 2.2.2.24.-1. Допустимое отклонение составляет +/- 1 нм для ультрафиолетового и +/- 3 нм для видимого диапазонов. Также могут быть использованы и другие сертифицированные стандартные образцы.

Таблица 2.1.2.24.-1. Максимумы поглощения (или испускания) для проверки шкалы длин волн

Проверка шкалы оптической плотности. Проверяют значения оптических плотностей, используя подходящие фильтры или калия дихромата раствор P при длинах волн, указанных в таблице 2.1.2.24.-2. В таблице 2.1.2.24.-2 приведены точные значения удельного показателя поглощения и его допустимые пределы для каждой длины волны. Данные таблицы основаны на допустимой погрешности при измерении поглощения +/- 0,01.

Таблица 2.1.2.24.-2. Значения удельного показателя поглощения и его допустимые пределы

Для проверки шкалы оптических плотностей используют растворы калия дихромата P, который предварительно сушат при температуре 130 °C до постоянной массы. Для проверки шкалы оптических плотностей при длинах волн 235 нм, 257 нм, 313 нм и 350 нм растворяют (57,0 - 63,0) мг калия дихромата P в 0,005 M растворе серной кислоты и доводят до объема 1000,0 мл этим же растворителем. Для проверки шкалы оптических плотностей при длине волны 430 нм растворяют (57,0 - 63,0) мг калия дихромата P в 0,005 M растворе серной кислоты и доводят до объема 100,0 мл этим же растворителем. Также могут быть использованы и другие сертифицированные стандартные образцы.

Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть определен при данной длине волны с использованием соответствующих фильтров или растворов. Например, оптическая плотность раствора 12 г/л калия хлорида P в кювете с толщиной слоя 1 см резко возрастает между 220 нм и 200 нм и имеет значение более 2,0 при 198 нм при использовании воды в качестве компенсационного раствора. Также могут быть использованы и другие сертифицированные стандартные образцы.

Разрешающая способность (для качественного анализа). Если указано в частной фармакопейной статье, то определяют разрешающую способность спектрофотометра следующим образом. Записывают спектр 0,02% (об/об) раствора толуола P в гексане P. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указывают в частной фармакопейной статье. Также могут быть использованы и другие сертифицированные стандартные образцы.

Ширина спектральной щели (для количественного анализа). В случае использования спектрофотометра с изменяемой шириной спектральной щели при выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели. Для их исключения ширина спектральной щели должна быть малой по сравнению с полушириной полосы поглощения и в то же время должна быть максимально велика для получения высокого уровня I0. Таким образом, ширина щели должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой оптической плотности.

Кюветы. Допустимые вариации в толщине слоя используемых кювет должны быть не более +/- 0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого и компенсационного растворов, должны иметь одинаковое пропускание (или оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать.

Чистка и обращение с кюветами должны быть аккуратными.

ПРОИЗВОДНАЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

В производной спектрофотометрии используется преобразование исходного спектра поглощения (нулевой порядок) в производные спектры первого, второго и более высоких порядков.

Производный спектр первого порядка представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности с длиной волны () от длины волны.

Производный спектр второго порядка представляет собой график зависимости кривизны спектра поглощения от длины волны . Вторая производная при любой длине волны X связана с концентрацией следующим соотношением:

где: - концентрация поглощающего раствора, в граммах на литр.

Прибор. Используют спектрофотометр, отвечающий указанным выше требованиям и оснащенный аналоговым резистентноемкостным дифференцирующим модулем, цифровым дифференциатором или другими средствами получения производных спектров. Некоторые методы получения производных спектров второго порядка сдвигают их относительно спектра нулевого порядка, что следует учитывать в случае применимости.

Разрешающая способность. Если указано в частной фармакопейной статье, записывают производный спектр второго порядка для раствора 0,02% (об/об) толуола P в метаноле P, используя метанол P в качестве компенсационного раствора. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, соответственно, как показано на рисунке 2.1.2.24.-1. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье отношение A/B (см. рисунок 2.1.2.24.-1) должно быть не менее 0,2.

Рисунок 2.1.2.24.-1. - Производный спектр второго порядка раствора 0,02% (об/об) толуола P в метаноле P

Методика. Готовят раствор испытуемого вещества, устанавливают различные инструментальные характеристики в соответствии с инструкцией к прибору и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в частной фармакопейной статье.

2.1.2.25. Бумажная хроматография

Бумажная хроматография представляет собой метод разделения, основанный на перемещении подвижной фазы по капиллярам и поверхности фильтровальной бумаги.

Неподвижной фазой является бумага или вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под действием капиллярных сил (восходящая бумажная хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая бумажная хроматография).

При хроматографировании определяемые вещества образуют на бумаге зоны адсорбции в виде круглых или овальных пятен или полос в зависимости от способа нанесения (в точку или полосой).

Бумажная хроматография может использоваться для идентификации, испытания на чистоту и количественное определение.

ВОСХОДЯЩАЯ БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Оборудование. Оборудование состоит из стеклянной камеры, по размеру соответствующей используемой хроматографической бумаге, с плотно пришлифованной крышкой. В верхней части камеры имеется специальное приспособление, удерживающее в подвешенном состоянии хроматографическую бумагу и способное опускать ее при закрытой камере. На дно камеры помещают лодочку с подвижной фазой, в которую опускают конец бумаги. Хроматографическую бумагу, представляющую собой подходящую фильтровальную бумагу, разрезают в направлении ее текстуры на полосы достаточной длины и шириной не менее 2,5 см.

Методика. Лодочку заполняют подвижной фазой до образования слоя глубиной 2,5 см. При указании в частной фармакопейной статье между стенками камеры и лодочки помещают хроматографическую бумагу. Для насыщения камеру закрывают крышкой и выдерживают обычно в течение 24 ч при температуре от 20 °C до 25 °C. Камеру термостатируют при данной температуре в течение всего испытания. Отступив от края 3 см, на хроматографической бумаге карандашом проводят горизонтальную линию (линия старта), на которую микропипеткой наносят объем раствора в соответствии с описанием в частной фармакопейной статье. Поскольку диаметр пятна не должен превышать 10 мм, большой объем раствора наносят в несколько приемов, позволяя каждой порции высохнуть перед следующим нанесением. При совместном хроматографировании нескольких растворов расстояние между пятнами на линии старта должно быть не менее 3 см. Бумагу помещают в камеру, закрывают ее крышкой и выдерживают в течение 1 ч 30 мин. Хроматографируют в течение времени или до расстояния, указанных в частной фармакопейной статье. Хроматограмму вынимают из камеры, сушат на воздухе. Хроматографическую бумагу защищают от яркого света в течение всего процесса разделения.

НИСХОДЯЩАЯ БУМАЖНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Оборудование. Оборудование состоит из стеклянной камеры, по размеру соответствующей используемой хроматографической бумаге, с плотно пришлифованной крышкой. В центре крышки должно быть отверстие диаметром около 1,5 см, закрытое тяжелой стеклянной пластиной или пробкой. В верхней части камеры подвешивают лодочку для подвижной фазы. На каждой стороне лодочки параллельно и чуть выше ее верхних краев устанавливают два стеклянных регулирующих стержня, удерживающих бумагу таким образом, чтобы она не соприкасалась со стенками камеры. Хроматографическую бумагу, представляющую собой подходящую фильтровальную бумагу, разрезают в направлении ее текстуры на полосы достаточной длины и шириной не менее 2,5 см и не более длины лодочки.

Методика. На дно камеры помещают указанную в частной фармакопейной статье подвижную фазу до образования слоя глубиной 2,5 см, закрывают крышкой и выдерживают в течение 24 ч при температуре от 20 °C до 25 °C. Камеру термостатируют при данной температуре в течение всего испытания. Карандашом проводят линию старта на одном конце бумаги, отступив от ее края на такое расстояние, чтобы линия находилась на несколько сантиметров выше регулирующего стержня и была параллельна ему после закрепления конца бумаги в лодочке. Остальная часть листа бумаги должна свободно свисать над регулирующим стержнем. На линию старта микропипеткой наносят указанный в частной монографии объем раствора. Поскольку диаметр пятна не должен превышать 10 мм, большой объем раствора наносят в несколько приемов, позволяя каждой порции высохнуть перед следующим нанесением. При совместном хроматографировании нескольких растворов расстояние между пятнами на линии старта должно быть не менее 3 см.

Хроматограмму помещают в камеру, закрывают ее крышкой и выдерживают в течение 1 ч 30 мин. Затем через отверстие в крышке заполняют лодочку подвижной фазой, закрывают отверстие и хроматографируют в течение времени или до расстояния, указанных в частной фармакопейной статье. Хроматограмму вынимают из камеры и сушат на воздухе. В процессе разделения хроматографическую бумагу защищают от яркого света.

2.1.2.26. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой метод разделения, основанный на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) определяемых веществ (аналитов), растворенных в растворителе или в соответствующей смеси растворителей (подвижной фазе). Неподвижная фаза состоит из подходящего материала, нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или полимера. Перед хроматографированием растворы определяемых веществ наносят на пластинку.

Усовершенствованный метод, позволяющий достигать лучших показателей чувствительности и эффективности разделения за счет использования специальных пластинок с более мелким размером частиц сорбента, носит название высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

ОБОРУДОВАНИЕ

Пластинки. Хроматографирование проводят с использованием пластинок, полученных в соответствии с указаниями общей фармакопейной статье 2.2.1.1. Реактивы. При описании испытаний размер частиц силикагеля указывается после его названия.

Предварительная подготовка пластинок. При необходимости перед использованием пластинки либо промывают путем хроматографирования в подходящем растворителе, либо пропитывают посредством элюирования, погружения или опрыскивания, либо, при необходимости, активируют, нагревая в сушильном шкафу при температуре 120 °C в течение 20 мин.

Хроматографическая камера для вертикального элюирования представляет собой емкость с плотно подогнанной крышкой и плоским дном или дном с двумя желобами из инертного прозрачного материала, соответствующими по размеру используемым пластинкам. Для горизонтального элюирования хроматографическая камера имеет желоб для подвижной фазы и дополнительно содержит устройство для подачи подвижной фазы к неподвижной фазе.

Микропипетки, микрошприцы, калиброванные капилляры или другие устройства, пригодные для нанесения растворов.

Устройство для обнаружения флуоресценции. Для измерения непосредственной флуоресценции или обнаружения тушения флуоресценции.

Проявляющие устройства и реактивы. Для проявления разделенных веществ используют подходящие устройства, пригодные для нанесения реактивов на пластинку (посредством опрыскивания, погружения или обработки парами) и, в случае применимости, нагревания.

Документирование. Допускается использование устройств, обеспечивающих регистрацию визуализированных хроматограмм, например, фотографирование или создание компьютерного файла.

МЕТОД

Нанесение. На линию, параллельную нижнему краю пластинки, на соответствующем расстоянии от ее нижнего края и сторон наносят указанные объемы растворов; расстояние между центрами круглых пятен должно составлять не менее 10 мм (5 мм для пластинок для ВЭТСХ), расстояние между краями полос - не менее 5 мм (2 мм для пластинок для ВЭТСХ). Растворы наносят минимальными порциями для получения пятен диаметром 2 - 5 мм (1 - 2 мм для пластинок для ВЭТСХ) или полос длиной 10 - 20 мм (5 - 10 мм для пластинок для ВЭТСХ) и шириной 1 - 2 мм.

Если в частной фармакопейной статье предусмотрено использование наряду с обычными пластинками пластинок для ВЭТСХ, рабочие условия для высокоэффективной тонкослойной хроматографии указывают в квадратных скобках [ ] после указания условий для обычных пластинок.

Вертикальное хроматографирование. Стенки хроматографической камеры выстилают фильтровальной бумагой. Подвижную фазу наливают в камеру в количестве, достаточном для того, чтобы после смачивания фильтровальной бумаги покрыть дно камеры слоем жидкости, необходимым для хроматографирования. Для насыщения хроматографическую камеру с подвижной фазой закрывают крышкой и выдерживают при температуре от 20 °C до 25 °C в течение 1 ч. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье хроматографирование проводят в насыщенной камере. Наносят указанные объемы растворов как описано выше. После испарения растворителей из нанесенных проб пластинку помещают в хроматографическую камеру как можно более вертикально, следя за тем, чтобы пятна или полосы находились выше поверхности подвижной фазы. Камеру закрывают, оставляют ее при температуре от 20 °C до 25 °C в защищенном от попадания прямых солнечных лучей месте. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна способом, указанным в частной фармакопейной статье.

В случае двумерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальное хроматографирование. Наносят указанные объемы растворов как описано выше. После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество подвижной фазы, помещают пластинку, убеждаясь, что она расположена горизонтально и подсоединена к устройству для подачи подвижной фазы в соответствии с инструкциями производителя. Если указано в частной фармакопейной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20 °C до 25 °C. После того, как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна указанным способом.

В случае двумерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

Ступенчатое хроматографирование. Наносят указанные объемы растворов как описано выше. В процессе хроматографирования ступенчато изменяют состав подвижной фазы либо иные условия хроматографирования. Например, ступенчатое хроматографирование с различными подвижными фазами применяют в случае, если для разделения анализируемой смеси недостаточно хроматографирования с использованием лишь одной подвижной фазы.

ВИЗУАЛЬНАЯ ОЦЕНКА

Идентификация. Визуально сравнивают цвет, размер и коэффициент замедления (RF) либо коэффициент Rst основного пятна на хроматограмме испытуемого раствора с соответствующим пятном на хроматограмме раствора сравнения.

Коэффициент замедления определяют как отношение расстояния от точки нанесения пробы до центра пятна и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы (см. общую фармакопейную статью 2.1.2.36.).

Проверка разделяющей способности неподвижной фазы для идентификации. Обычно для оценки пригодности достаточно испытания на пригодность неподвижной фазы, описанного в общей фармакопейной статье 2.2.1.1. Реактивы. В особых случаях дополнительные требования указывают в частной фармакопейной статье.

Испытание на родственные примеси. Дополнительное(ые) пятно(а) на хроматограмме испытуемого раствора сравнивают визуально с соответствующим(и) пятном(ами) на хроматограмме раствора сравнения, содержащего примесь (примеси), или раствора сравнения, приготовленного путем разведения испытуемого раствора.

Проверка разделяющей способности. Требования для проверки разделяющей способности приводят в соответствующих частных фармакопейных статьях.

Проверка чувствительности. Чувствительность считается удовлетворительной, если на хроматограмме наиболее разведенного раствора сравнения четко обнаруживается пятно или полоса.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕРЕНИЯ

Требования к разрешению и разделению приводят в соответствующих частных фармакопейных статьях.

В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии, поглощают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом свете, их можно количественно определить непосредственно на пластинке, используя подходящее оборудование. Для этого измеряют отражение или пропускание падающего света, передвигая пластинку или измеряющее устройство. Аналогичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию. Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены тремя способами:

- непосредственно на пластинке - передвигая пластинки вдоль подходящего счетчика радиоактивности или счетчика радиоактивности вдоль пластины (см. общую фармакопейную статью Радиофармацевтические препараты);

- разрезанием пластинки на полосы и измерением радиоактивности на каждой полосе, используя подходящий счетчик радиоактивности;

- соскребанием неподвижной фазы, растворением ее в подходящем сцинтилляционном коктейле и измерением радиоактивности с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Оборудование. Оборудование для измерений непосредственно на пластинке включает в себя:

- устройство для точного нанесения в определенном месте пластинки необходимого количества вещества;

- механическое устройство для передвижения пластинки или измерительного устройства вдоль осей X или Y;

- регистрирующее устройство и интегратор или компьютер;

- для веществ, поглощающих или флуоресцирующих в ультрафиолетовом или видимом свете: для измерения отражения или пропускания используются фотометр с источником света, оптическое устройство, генерирующее монохроматический свет, и фотоэлемент соответствующей чувствительности; в том случае, когда измеряется флуоресценция, требуется дополнительно монохроматический фильтр для выбора соответствующей спектральной области излучаемого света;

- для веществ, содержащих радионуклиды: подходящий счетчик радиоактивности; для него необходимо проверить линейность диапазона.

Методика. Готовят раствор испытуемого образца (испытуемый раствор) в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье и, при необходимости, растворы стандартных образцов анализируемых веществ (растворы сравнения), используя тот же растворитель, что и для приготовления испытуемого раствора. На пластинку наносят одинаковые объемы каждого из растворов и хроматографируют.

Вещества, поглощающие или флуоресцирующие в ультрафиолетовом или видимом свете. Готовят и наносят не менее трех растворов сравнения, концентрации которых охватывают предполагаемое значение концентрации испытуемого раствора (около 80%, 100% и 120% от этой концентрации). Обрабатывают, при необходимости, указанным реактивом и регистрируют отражение, пропускание или флуоресценцию на хроматограммах испытуемого раствора и растворов сравнения. По полученным данным рассчитывают количество вещества в испытуемом растворе.

Вещества, содержащие радионуклиды. Готовят и наносят испытуемый раствор, содержащий около 100% предполагаемого значения концентрации. Измеряют радиоактивность как функцию длины пути и записывают значение радиоактивности каждого полученного пика в процентах от суммарной радиоактивности.

Критерии оценки пригодности системы приведены в общей фармакопейной статье 2.1.2.36. Хроматографические методы разделения. В данной статье также приведены пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической системы для соответствия критериям ее пригодности.

2.1.2.27. Газовая хроматография

Газовая хроматография (ГХ) представляет собой метод хроматографического разделения, основанный на различном распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами, в котором газ-носитель, являющийся подвижной фазой, проходит через неподвижную фазу, находящуюся в колонке. Метод может быть применен к летучим или летучим при нагревании веществам или их производным.

Газовая хроматография основана на механизмах адсорбции, распределения по массам или размерам (эксклюзии).

ПРИБОР

Прибор состоит из блока ввода проб (инжектора), хроматографической колонки, помещенной в термостат, детектора и регистрирующего устройства (интегрирующее устройство со специальным программным обеспечением или самописец). Газ-носитель проходит с заданной скоростью или давлением через колонку, а затем через детектор.

Определение проводят при постоянной температуре колонки или в соответствии с заданной температурной программой.

БЛОК ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОР)

Прямой ввод растворов является обычным способом ввода проб, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. Ввод пробы может осуществляться либо непосредственно в начало колонки с использованием шприца или инжекторного клапана, либо в испаритель, который может оснащаться делителем потока.

Ввод паровой фазы может осуществляться с использованием статической или динамической парофазной системы ввода.

Динамическая парофазная (продувка и ловушка) система ввода включает барботажную установку, при помощи которой летучие вещества в растворе продуваются через поглотительную трубку при невысокой температуре. Удерживаемые вещества затем десорбируются в подвижную фазу при быстром нагревании поглотительной трубки.

Статическая парофазная система ввода включает термостатируемую нагревающую камеру для образцов, в которую помещены закрытые флаконы с твердыми или жидкими образцами на фиксированный период времени, позволяющий летучим компонентам образца достичь равновесия между негазовой и паровой фазами. После достижения равновесия заданное количество паровой фазы из флаконов вводится в газовый хроматограф.

НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА

Типы колонок, заполненных неподвижными фазами:

- капиллярные, как правило, кварцевые колонки, внутренние стенки которых покрыты неподвижной фазой;

- набивные колонки, заполненные инертными частицами, импрегнированными неподвижной фазой;

- набивные колонки, заполненные твердой неподвижной фазой.

Капиллярные колонки, как правило, имеют внутренний диаметр от 0,1 мм до 0,53 мм и длину от 5 м до 60 м. Жидкость или неподвижная фаза, которая может быть химически связана с внутренней поверхностью, представляет собой пленку толщиной от 0,1 мкм до 5,0 мкм.

Набивные колонки, изготовленные из стекла или металла, имеют длину обычно от 1 м до 3 м и внутренний диаметр от 2 мм до 4 мм. Неподвижная фаза обычно состоит из пористых полимеров или твердых носителей, импрегнированных жидкой фазой. Во избежание образования пика с растянутым задним фронтом ("хвостом") при определении полярных соединений на колонках, заполненных неподвижной фазой с низкой емкостью и низкой полярностью, следует использовать инертные носители.

Реакционная способность носителей может быть снижена путем силанизации, предшествующей нанесению жидкой фазы. Обычно используют обработанный кислотой и прокаленный диатомит. Размер частиц может быть разный, но наиболее часто используются частицы размером от 150 мкм до 180 мкм и от 125 мкм до 150 мкм.

ПОДВИЖНАЯ ФАЗА

Скорость потока газа-носителя влияет на время удерживания и характеристики пика; время удерживания прямо пропорционально длине колонки, а разрешение пропорционально квадратному корню из длины колонки. Для набивных колонок скорость потока газа-носителя обычно выражают в миллилитрах в минуту при атмосферном давлении и комнатной температуре. Скорость потока измеряется при рабочей температуре колонки на выходе из детектора с помощью калиброванного механического устройства или пенного измерителя. Линейная скорость газа-носителя через набивную колонку обратно пропорциональна корню квадратному из внутреннего диаметра колонки для заданного объема потока. Скорости потока 60 мл/мин при внутреннем диаметре колонки 4 мм и 15 мл/мин при внутреннем диаметре 2 мм дают идентичные линейные скорости и, следовательно, близкие времена удерживания.

В качестве газа-носителя для набивных колонок обычно используют гелий или азот, для капиллярных - азот, гелий и водород.

ДЕТЕКТОРЫ

Обычно используют пламенно-ионизационные детекторы; кроме этого, в зависимости от цели анализа могут применяться следующие типы детекторов: электронного захвата, азотно-фосфорный, масс-спектрометрический, термокондуктометрический, ИК-спектрофотометрический с Фурье-преобразованием и другие.

МЕТОД

Колонку, блок ввода пробы и детектор уравновешивают при указанной в частной фармакопейной статье температуре и скорости газа-носителя до получения стабильной базовой линии. Готовят испытуемый(е) раствор(ы) и раствор(ы) сравнения, как указано в частной фармакопейной статье. Растворы не должны содержать твердых частиц.

Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.36. Хроматографические методы разделения. В данной статье также приведены пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической системы для соответствия критериям ее пригодности.

Статическая парофазная газовая хроматография

Статическая парофазная газовая хроматография является методом, наиболее подходящим для разделения и определения летучих соединений, которые присутствуют в твердых или жидких образцах. Метод основан на анализе паровой фазы, находящейся в равновесии с твердой или жидкой фазой.

ПРИБОР

Прибор состоит из газового хроматографа, снабженного блоком для ввода испытуемого образца, который может быть связан с модулем автоматического контроля давления и температуры. При необходимости используют устройство для удаления растворителей,

Испытуемый образец вносят во флакон, снабженный подходящей пробкой и клапанной системой, которая регулирует прохождение газа-носителя. Флакон помещают в термостатируемую камеру с температурой, устанавливаемой в соответствии со свойствами испытуемого образца. Флакон выдерживают при заданной температуре в течение времени, достаточного для установления равновесия между твердой или жидкой фазой и паровой фазой.

Во флакон вводят газ-носитель и по истечении указанного времени открывают клапан, чтобы газ поступал в хроматографическую колонку, перенося с собой перешедшие в паровую фазу компоненты.

Вместо специально оснащенного блока для ввода проб хроматографа возможно использование газовых шприцов и обычного хроматографа. Уравновешивание в таком случае проводится в отдельной камере, а паровая фаза вводится в колонку с соблюдением необходимых мер предосторожности для предотвращения любых изменений в равновесной системе.

МЕТОД

Настраивают прибор для получения необходимого сигнала, используя подготовленные образцы сравнения.

МЕТОД ПРЯМОЙ КАЛИБРОВКИ

В одинаковые флаконы раздельно помещают испытуемый образец и каждый из образцов сравнения, приготовленные, как указано в частной фармакопейной статье, избегая контакта между блоком для ввода проб и образцами.

Флаконы герметично закрывают и помещают в термостатируемую камеру с температурой и давлением, указанными в частной фармакопейной статье. После установления равновесия паровую фазу хроматографируют в указанных условиях.

МЕТОД СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК

Равные объемы испытуемого образца помещают в одинаковые подходящие флаконы. Во все флаконы, кроме одного, прибавляют указанные количества раствора сравнения, содержащего известную концентрацию определяемого вещества, для получения ряда образцов с равномерно увеличивающимися концентрациями этого вещества.

Флаконы герметично закрывают и помещают в термостатируемую камеру с температурой и давлением, указанными в частной фармакопейной статье. После установления равновесия хроматографирование проводят в указанных условиях.

Уравнение линейной зависимости рассчитывают методом наименьших квадратов. По полученному уравнению определяют концентрацию определяемого вещества в испытуемом образце.

Допускается определение концентрации с использованием графического метода. Для этого по оси ординат откладывают средние значения полученных результатов, а по оси абсцисс - концентрации стандартных добавок определяемого вещества. Экстраполируют линию, проходящую через полученные точки, до пересечения с осью абсцисс. Расстояние между этой точкой и началом координат представляет собой концентрацию определяемого вещества в испытуемом образце.

МЕТОД ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫХ ОТБОРОВ (МНОГОКРАТНАЯ ПАРОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ)

Если используется многократная парофазная экстракция, этот метод должен быть полностью описан в частной фармакопейной статье.

2.1.2.28. Высокоэффективная жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) представляет собой метод разделения, основанный на различном распределении веществ между двумя не смешивающимися фазами, в котором жидкость, являющаяся подвижной фазой, проходит через неподвижную фазу, помещенную в колонку с высоким гидравлическим сопротивлением. Жидкостная хроматография, в которой используются колонки с уменьшенным размером частиц (например, менее 2 мкм) называется сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографией (СВЭЖХ).

В последнем случае требуется оборудование, характеризующееся следующим: возможность использования высоких давлений (обычно до 100 МПа, то есть около 15 000 psi), уменьшенное внеколоночное уширение пиков, улучшенные параметры градиентного смешивания и увеличенная скорость получения данных системой детектирования.

Жидкостная хроматография в зависимости от механизма разделения веществ может быть адсорбционной, распределительной, ионообменной, эксклюзионной, хиральной и др. в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий. Каждый из этих видов может быть высокоэффективным, если для проведения хроматографии используется режим хроматографирования с высоким давлением в колонке.

ПРИБОР

Прибор обычно состоит из узла подготовки подвижной фазы с системой дегазации, насосной системы, смесителя подвижной фазы (при необходимости), блока ввода пробы (инжектора), хроматографической колонки (может использоваться устройство контроля температуры колонки), детектора и системы сбора и обработки данных (интегрирующее устройство или самописец). Помимо этого в состав хроматографа могут входить: система пробоподготовки и предколоночный реактор, система переключения колонок, постколоночный реактор и другое оборудование. Подвижная фаза из одной или нескольких емкостей протекает обычно с постоянной скоростью через колонку, а затем через детектор.

НАСОСНАЯ СИСТЕМА

Насосная система необходима для поддержания контролируемой скорости подачи подвижной фазы. Колебания давления должны быть минимизированы, например, путем пропускания подвижной фазы, находящейся под давлением, через демпферное устройство. Проводящая система капилляров и соединительные узлы должны выдерживать давление, которое развивается при работе насосной системы. Насосные системы, использующиеся в высокоэффективной жидкостной хроматографии, могут оснащаться дегазаторами.

Системы подачи подвижной фазы, контролируемые микропроцессором, должны обеспечивать точную подачу подвижной фазы постоянного (изократическое элюирование) или переменного (градиентное элюирование) состава в соответствии с определенной программой. В случае градиентного элюирования используют насосные системы, подающие растворитель (растворители) из нескольких резервуаров, смешивание которых происходит при низком либо высоком давлении, создаваемом насосами.

БЛОК ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОР)

Раствор испытуемого образца вводится в поток подвижной фазы, поступающей в колонку, при помощи блока ввода проб, функционирующего при высоком давлении. Для ввода пробы используют петлевые дозаторы фиксированного объема или устройства с регулируемым объемом, которые могут управляться вручную или автоматически. Частичное заполнение петлевого дозатора вручную снижает точность вводимого объема пробы.

НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются неподвижные фазы следующих типов:

- силикагель, оксид алюминия или пористый графит, используемый в нормально-фазовой хроматографии, в которой разделение основано на разнице в адсорбции и/или массовом распределении (распределительная хроматография);

- большое количество химически модифицированных носителей, изготовленных из полимеров, силикагеля или пористого графита, используемых в нормально-фазовой (адсорбционная хроматография) и обращенно-фазовой хроматографии, в которой разделение основано на разделении молекул между подвижной и неподвижной фазой;

- смолы или полимеры, модифицированные кислотными или основными группами, используемые в ионообменной хроматографии, в которой разделение основано на конкурирующем взаимодействии между разделяемыми ионами и ионами подвижной фазы;

- пористый силикагель или полимеры, используемые в эксклюзионной хроматографии, в которой разделение основано на разнице в размерах молекул, соответствующих стерической эксклюзии;

- специальные химически модифицированные неподвижные фазы, например, производными целлюлозы или амилозы, белками и пептидами, циклодекстринами и т.д., используемые для разделения энантиомеров (хроматография на хиральных неподвижных фазах);

- другие неподвижные фазы, используемые в высокоэффективных модификациях различных типов жидкостной хроматографии.

Большая часть разделений основана на механизме распределения между химически модифицированным силикагелем, использующимся в качестве неподвижной фазы, и полярными растворителями, использующимися в качестве подвижной фазы. Поверхность носителя, например, силанольные группы силикагеля, реагирует с различными силановыми реагентами с образованием ковалентно связанных силильных производных, покрывающих различное число активных групп на поверхности носителя. Природа привитой фазы является важной характеристикой, определяющей разделяющие свойства хроматографической системы.

Ниже представлены наиболее часто используемые привитые фазы:

При отсутствии других указаний производителя, находящаяся в колонках обращенно-фазовая неподвижная фаза на основе силикагеля считается стабильной в подвижных фазах при значениях pH в диапазоне от 2,0 до 8,0. Колонки, содержащие пористый графит или частицы полимерных материалов, например, сополимера стирола с дивинилбензолом, стабильны в более широком диапазоне значений pH.

В некоторых случаях для анализа применяют нормально-фазовую хроматографию, используя в качестве неподвижной фазы немодифицированный силикагель, пористый графит или силикагель, химически модифицированный полярными группами (например, цианопропильными или диольными).

Размер частиц для большинства используемых неподвижных фаз составляет от 2 мкм до 10 мкм. Частицы могут иметь сферическую или неправильную форму, различную пористость и удельную площадь поверхности. Эти параметры определяют хроматографическое поведение конкретных неподвижных фаз. В обращенно-фазовой хроматографии дополнительными определяющими факторами являются природа неподвижной фазы, степень связывания, выражаемая содержанием углерода, и эндкепирование (т.е. силилирование оставшихся силанольных групп). Остаточные силанольные группы могут являться причиной размывания заднего фронта пика, особенно для веществ основного характера.

Кроме пористых частиц могут быть использованы поверхностно-пористые или монолитные материалы.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье в аналитической хроматографии используют колонки из нержавеющей стали различной длины и внутреннего диаметра. Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм часто относят к микроколонкам. Температура подвижной фазы и колонки в течение анализа должна быть постоянной. Большинство анализов проводится при комнатной температуре, но для обеспечения оптимального функционирования колонки может потребоваться использование других температур.

ПОДВИЖНАЯ ФАЗА

В нормально-фазовой хроматографии обычно используют малополярные органические растворители (гексан, циклогексан, гептан и др.) с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу подвижной фазы. Для получения воспроизводимых результатов в нормально-фазовой хроматографии необходимо строго контролировать содержание воды в растворителях, использующихся в подвижной фазе.

В обращенно-фазовой хроматографии используют водные подвижные фазы, содержащие или не содержащие органические растворители. Органическими добавками обычно служат полярные органические растворители (ацетонитрил и метанол). Для оптимизации разделения могут использоваться водные растворы с определенным значением pH, в частности буферные растворы, а также различные добавки в подвижную фазу: фосфорная и уксусная кислоты при разделении соединений кислотного характера; аммиак и алифатические амины при разделении соединений основного характера, и другие модификаторы.

Компоненты подвижной фазы обычно фильтруют для удаления частиц с размером более 0,45 мкм (или 0,2 мкм, если неподвижная фаза состоит из частиц размером менее 2 мкм, а также, если используются специальные детекторы, например, детектор светорассеяния). При приготовлении многокомпонентных подвижных фаз смешивают отмеренные объемы (если массы не указаны) индивидуальных компонентов. Кроме этого, растворители могут подаваться индивидуальными насосами, снабженными дозирующими клапанами, с помощью которых осуществляют смешивание растворителей в необходимых пропорциях. Во избежание образования пузырьков газа и попадания их в ячейку детектора растворители обычно дегазируют путем пропускания через них гелия, обработкой ультразвуком и/или использованием мембранно-вакуумных модулей, работающих в режиме "on-line".

Растворители для приготовления подвижных фаз обычно не содержат стабилизаторов, а при использовании ультрафиолетовых детекторов должны быть прозрачными при длине волны детектирования. Растворители и другие компоненты подвижной фазы должны быть приемлемого качества. При необходимости значение pH корректируют, используя только водный компонент подвижной фазы, но не смеси. При использовании буферных или солевых растворов для предотвращения кристаллизации солей по окончании хроматографирования систему промывают смесью воды и небольшого количества органической части подвижной фазы (5% (об/об)).

Подвижные фазы могут содержать другие компоненты, например, контр-ионы для ион-парной хроматографии или хиральные селекторы для хроматографии, использующей ахиральные неподвижные фазы.

ДЕТЕКТОРЫ

Наиболее часто в качестве детекторов используют спектрофотометры, работающие в ультрафиолетовой/видимой областях. Спектрофотометрический детектор позволяет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапазоне (как правило, 190 - 600 нм). Применяются также многоволновые детекторы, позволяющие проводить детектирование при нескольких длинах волн одновременно, идиодноматричные детекторы, с помощью которых можно регистрировать оптическую плотность одновременно во всем рабочем диапазоне длин волн (как правило, 190 - 950 нм). Это позволяет регистрировать спектры поглощения проходящих через ячейку детектора компонентов. Кроме этого могут использоваться специальные детекторы. Флуоресцентный детектор применяется для определения флуоресцирующих соединений или не флуоресцирующих соединений в виде их флуоресцирующих производных, и обладает очень высокой чувствительностью и селективностью. Для определения соединений, слабо поглощающих в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы (рефрактометры). Недостатки этих детекторов - их относительно низкая чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать), а также невозможность их использования в режиме градиентного элюирования. Кроме того, могут использоваться электрохимические детекторы (амперометрический, кондуктометрический) для электроактивных соединений, светорассеивающие детекторы, детекторы заряженных аэрозолей, масс-спектрометрические детекторы, обладающие очень высокой чувствительностью и селективностью, Фурье-ИК-детекторы, детекторы радиоактивности и другие.

СИСТЕМА СБОРА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ

Современная система обработки данных представляет собой сопряженный с хроматографом персональный компьютер с установленным программным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хроматограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основными параметрами хроматографической системы.

МЕТОДИКА

Колонку уравновешивают при указанном составе и скорости подвижной фазы, а также при комнатной температуре или температуре, указанной в частной фармакопейной статье, до получения стабильной базовой линии. Готовят испытуемый(е) раствор(ы) и раствор(ы) сравнения, в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье. Растворы не должны содержать твердых частиц. Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.36. Хроматографические методы разделения. В данной статье также приведены пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической системы без принципиального изменения методики для соответствия критериям ее пригодности.

2.1.2.29. Эксклюзионная хроматография

Эксклюзионная хроматография представляет собой хроматографический метод разделения молекул в растворе в соответствии с их размерами. При использовании органической подвижной фазы метод называют гель-проникающей хроматографией, а при использовании водной подвижной фазы - гель-фильтрационной хроматографией. Проба вводится в колонку, заполненную гелем или пористыми частичками наполнителя, и переносится подвижной фазой через колонку. Разделение в соответствии с размерами происходит за счет неоднократного обмена молекул растворенного вещества между молекулами растворителя подвижной фазы и тем же растворителем, находящимся в порах материала, которым заполнена колонка (неподвижная фаза). Диапазон размеров распределяемых молекул определяется диапазоном размеров пор наполнителя.

Достаточно маленькие молекулы проникают во все поры материала наполнителя и элюируются в полном проникающем объеме колонки (Vt). Молекулы с размерами, превышающими размер всех пор материала колонки, мигрируют лишь через пространство между частицами наполнителя, не удерживаясь им, и элюируются в свободном объеме колонки или объеме эксклюзии (V0, объем пустот). Разделение молекул в соответствии с размерами происходит между объемом эксклюзии и полным проникающим объемом колонки; наиболее эффективное разделение происходит в первые две трети данного диапазона.

ПРИБОР

Основной частью прибора является хроматографическая колонка с различными длиной и внутренним диаметром, заполненная материалом, обеспечивающим разделение молекул по размерам в необходимом диапазоне. При необходимости колонку термостатируют. Через колонку с постоянной скоростью пропускают элюент. К одному концу колонки обычно присоединяют блок для ввода проб, например, инжектор с прерывателем потока, шприцевой инжектор с мембраной для ввода проб без приостановки потока или петлевой инжектор с клапаном, перекрывающий поток. К этому же концу колонки также может быть присоединен соответствующий насос для подачи элюента с контролируемой скоростью. Проба может также наноситься непосредственно на сухую поверхность материала колонки или, если плотность пробы превышает плотность элюента, может наслаиваться на поверхность материала колонки под элюент. Другой конец колонки обычно присоединяют к соответствующему детектору с автоматическим регистрирующим устройством, обеспечивающим контроль относительных концентраций разделенных компонентов пробы. Обычно используют детекторы: фотометрический, рефрактометрический или люминесцентный. При необходимости, может быть присоединен автоматический коллектор фракций.

В качестве неподвижной фазы может использоваться или мягкий носитель, например, набухший гель, или твердый - пористое стекло, силикагель или подходящий для данного растворителя поперечно-сшитый органический полимер. При использовании твердых носителей обычно требуется подача подвижной фазы под давлением, что ускоряет разделение. Подвижную фазу выбирают исходя из природы пробы, наполнителя и метода детектирования. Перед проведением разделения неподвижную фазу обрабатывают и заполняют колонку в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье или инструкцией производителя.

Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.36. Хроматографические методы разделения. В данной статье также приведены пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической системы для соответствия критериям ее пригодности.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА СМЕСЕЙ

Разделение проводят в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье. По возможности постоянно контролируют элюирование компонентов и измеряют площади соответствующих пиков. Если контроль пробы проводится по физико-химическому свойству, по которому все рассматриваемые компоненты дают одинаковые аналитические сигналы (например, одинаковое удельное оптическое поглощение), относительное содержание каждого компонента рассчитывают как отношение площади пика соответствующего компонента к сумме площадей пиков всех компонентов. Если аналитические сигналы компонентов по детектируемому свойству отличаются, содержание каждого компонента рассчитывают по калибровочным графикам, полученным с использованием соответствующих стандартных образцов, как указано в частной фармакопейной статье.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярных масс веществ путем сравнения с соответствующими стандартными образцами для калибровки, указанными в частной фармакопейной статье. Для стандартных образцов строят график зависимости объема удерживания веществ от логарифма их молекулярных масс. График, построенный в пределах, ограниченных значениями объема эксклюзии и полного проникающего объема, обычно приближается к прямой линии для данной колонки в данных экспериментальных условиях. По данному графику могут быть рассчитаны значения молекулярных масс. Использование метода калибровочного графика для молекулярно-массового распределения позволяет получать достоверные результаты лишь для частных случаев систем высокомолекулярное вещество/растворитель в описанных экспериментальных условиях.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИМЕРОВ

Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярно-массового распределения полимеров. Однако сравнить между собой можно лишь результаты, полученные в одинаковых экспериментальных условиях. Стандартные образцы, используемые для калибровки, и методики определения молекулярно-массового распределения полимеров приводят в частных фармакопейных статьях.

2.1.2.30. Электрофорез

1. ОБЩИЙ ПРИНЦИП

Под действием электрического поля заряженные частицы, растворенные или диспергированные в растворе электролита, передвигаются в направлении электрода противоположной полярности. При электрофорезе в геле движение частиц замедляется взаимодействием с окружающей гель-матрицей, действующей как молекулярное сито. Противоположные взаимодействия электрического тока и молекулярного сита приводят к различиям в скорости миграции частиц в зависимости от их размеров, форм и зарядов. Вследствие различий физико-химических свойств разные макромолекулы в смеси будут мигрировать с разной скоростью при электрофорезе и, таким образом, будут разделены на дискретные фракции. Электрофоретическое разделение может быть проведено в системах без опорных фаз (например, разделение свободного раствора в капиллярном электрофорезе) и в стабилизированных средах, таких, как тонкослойные пластины, пленки или гели.

2. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В СВОБОДНОМ РАСТВОРЕ ИЛИ ФРОНТАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Этот метод в основном используется для определения электрофоретической подвижности, являющейся экспериментальной непосредственно измеряемой и воспроизводимой характеристикой веществ. Метод обычно применяется для веществ с высокой относительной молекулярной массой, которые имеют малую способность к диффузии. Перед началом определения фиксируют месторасположение границ физическими методами, например, рефрактометрией или кондуктометрией. После наложения определенного электрического поля, в течение точно измеренного времени, определяют новые границы и их относительное положение. Условия испытания подбирают так, чтобы можно было определять столько границ, сколько веществ присутствует в испытуемом образце.

3. ЗОННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФАЗЫ НОСИТЕЛЯ

Для проведения этого испытания требуется лишь небольшое количество испытуемого образца.

Природа носителя, например, бумага, агарозный гель, ацетат целлюлозы, крахмал, агароза, полиакриламид, смешанный гель, служит причиной ряда дополнительных факторов, влияющих на подвижность:

а) вследствие капиллярных эффектов в фазе носителя кажущееся пройденное расстояние меньше реального пройденного расстояния;

б) некоторые фазы носителя не являются электрически нейтральными. Поскольку носители являются неподвижной фазой, это иногда может приводить к значительному электроэндоосмотическому потоку;

в) любое нагревание в результате эффекта Джоуля может вызвать некоторое испарение жидкости с фазы носителя, что вследствие капиллярного эффекта приводит к движению раствора в направлении от краев к центру. Ионная сила в этом случае возрастает.

Следовательно, скорость передвижения зависит от четырех главных факторов: подвижности заряженной частицы, скорости потока электроэндоосмоса, испарения жидкости с фазы носителя, напряженности поля. Поэтому необходимо проводить испытание в строго определенных экспериментальных условиях и, по возможности, использовать стандартные вещества.

Основными составляющими прибора для электрофореза являются:

- Источник постоянного тока, напряжение которого можно контролировать и, желательно, стабилизировать.

- Электрофоретическая камера. Обычно это камера из стекла или твердого полимера, состоящая из двух отдельных резервуаров - анодного и катодного, содержащих раствор электролита. В каждый резервуар камеры погружается электрод, например, платиновый или графитовый. Они присоединяются изолированной схемой к соответствующему выходу источника питания и образуют анод и катод. Для предотвращения сифонирования уровень жидкости в обоих резервуарах камеры поддерживается одинаковым.

Электрофоретическая камера снабжена воздухонепроницаемой крышкой, которая поддерживает атмосферу насыщенной влажности на протяжении испытания и уменьшает испарение растворителя. При снятии крышки ток отключается предохранителем. Если мощность тока, измеренная поперек полосы, превышает 10 Вт, желательно охладить камеру.

- Приспособление установки носителя:

Электрофорез на полосках. Каждый конец несущей полоски, предварительно смоченной тем же электролитом, погружают в электродную камеру, закрепляют и фиксируют соответствующим держателем для предупреждения диффузии электролита. Такими держателями могут быть горизонтальная рамка, перевернуто-V-образная подставка или однородная поверхность с точками контакта через определенные интервалы.

Гель-электрофорез. Приспособление в основном состоит из стеклянной пластинки (например, предметное стекло), на поверхность которой нанесен слой хорошо закрепленного геля одинаковой толщины. Соединение геля с электролитом осуществляется разными способами в зависимости от типа используемого прибора. Необходимо принять меры для предупреждения конденсации воды или высыхания твердого слоя.

- Измерительное устройство или детектор.

Методика. Раствор электролита помещают в электродные отделения. Носитель, пропитанный раствором электролита, помещают в камеру в соответствии с инструкцией для используемого прибора. Устанавливают линию старта и наносят образец. Подают электрический ток в течение указанного времени. После отключения тока носитель вынимают из камеры, высушивают и проявляют.

4. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА КОЛОНКАХ С ПОЛИАКРИЛАМИДНЫМ ГЕЛЕМ

При электрофорезе на колонках с полиакриламидным гелем стационарной фазой является гель, приготовленный из смеси акриламида и N,N'-метиленбисакриламида. Колонки с гелем готовят с использованием трубок длиной 7,5 см и внутренним диаметром 0,5 см, во всех трубках должен быть использован один и тот же раствор.

Прибор. Прибор состоит из двух вставленных вертикально один над одним резервуаров для буферного раствора, изготовленных из подходящего материала, например, поли(метилметакрилата). Каждый резервуар снабжен платиновым электродом. Электроды присоединены к источнику тока, что позволяет проводить испытание либо при постоянном токе, либо при постоянном напряжении. В основании верхнего резервуара имеется ряд держателей, равноудаленных от электрода.

Методика. Обычно растворы дегазируют до начала полимеризации, гели используют сразу после приготовления. Готовят предписанную смесь компонентов, заливают ее в соответствующие закрытые снизу стеклянные трубки до одинакового уровня, не достигая около 1 см от верхнего края, избегая попадания пузырьков воздуха в трубки. На смесь наслаивают слой воды P, чтобы исключить контакт с воздухом, и оставляют для полимеризации. Гелеобразование обычно занимает около 30 минут и завершается, когда образуется граница, четко разделяющая поверхности геля от слоя воды. Водный слой удаляют. Нижний резервуар наполняют предписанным буферным раствором. Стеклянные трубки открывают (снимают колпачки с нижнего конца) и вставляют в держатели верхнего резервуара так, чтобы дно трубок было погружено в буферный раствор нижнего резервуара. Колонки осторожно наполняют предписанным буферным раствором. Готовят испытуемые и контрольные образцы, содержащие предписанный индикаторный краситель, и уплотняют путем растворения в них, например, сахарозы P.

Приготовленные образцы наслаивают на поверхность геля, используя для каждого образца отдельную трубку. Верхний резервуар наполняют тем же буферным раствором. Электроды подключают к источнику тока и проводят процесс электрофореза при заданной температуре и с использованием заданного постоянного напряжения или тока.

Источник тока отключают, когда индикаторный краситель почти переходит в нижний резервуар. Каждую трубку сразу вынимают из прибора и путем выдавливания извлекают гель. Определяют, как предписано, местоположение полос на электрофореграмме.

5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ, СОДЕРЖАЩЕМ ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТ НАТРИЯ (ДСН-ПААГ)

5-1. ДСН-ПААГ - ГЕЛИ С ОДНОРОДНОЙ КОНЦЕНТРАЦИЕЙ

Область применения. Электрофорез в полиакриламидном геле применяется для качественной идентификации белков в биологических препаратах, контроля их чистоты и количественных определений.

Цель. Аналитический гель-электрофорез - метод, позволяющий идентифицировать и оценить гомогенность белков в лекарственных средствах. Метод обычно используется для определения молекулярных масс белковых субъединиц и субъединичного состава очищенных белков.

Готовые гели и реактивы широко доступны на рынке и могут быть использованы вместо описанных в данной фармакопейной статье, при условии, что они дают эквивалентные результаты и отвечают требованиям раздела "Валидация испытания", приведенного ниже.

5-1-1. СВОЙСТВА ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ

Разделяющие свойства полиакриламидных гелей (ПААГ) обусловлены трехмерной сетью волокон и пор, образующихся благодаря бифункциональным бис-акриламидным поперечным связям между соседними полиакриламидными цепями. Процесс полимеризации катализируется системой, генерирующей свободные радикалы, состоящей из аммония персульфата и N,N,N",N'-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЭД).

При увеличении концентрации акриламида уменьшается эффективный размер пор в геле. Эффективный размер пор геля функционально определяется его просеивающими свойствами, то есть сопротивлением, которое он придает миграции макромолекул. Существуют ограничения на концентрации акриламида, которые могут быть использованы. При высоких концентрациях акриламида гели становятся более ломкими и трудны в обращении. С уменьшением размера пор геля скорость миграции белка через гель уменьшается. Регулируя размер пор и концентрацию акриламида, можно оптимизировать разрешающую способность метода для конкретного анализируемого белкового продукта. Таким образом, свойства конкретного геля определяются процентным содержанием в нем акриламида и бисакриламида.

Кроме состава геля, важным компонентом электрофоретической подвижности является состояние анализируемого белка. Электрофоретическая подвижность белка зависит от значения pH заряженных групп и размера молекулы. На подвижность влияют тип, концентрация и pH буферного раствора, температура и напряжение электрического поля, а также природа материала носителя.

5-1-2. ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Данный метод позволяет анализировать мономеры полипептидов с молекулярной массой от 14 000 до 100 000 дальтон. Возможно расширение границ молекулярных масс с использованием различных методик (например, путем использования градиентных гелей, определенных буферных систем). Например, трицин-ПААГ гели, содержащие трицин в качестве отстающего иона в разделяющем буферном растворе для электрофореза (вместо глицина, как в методе, описанном выше), позволяют разделять очень маленькие белки и пептиды от менее 10 000 до 15 000 дальтон.

Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с использованием натрия додецилсульфата (ДСН-ПААГ) является наиболее общепринятым методом электрофореза, который используется для оценки качества белков в фармацевтической продукции и описан ниже в качестве примера указанного метода. Как правило аналитический электрофорез белков проводят в полиакриламидных гелях в условиях, обеспечивающих их диссоциацию на отдельные полипептидные субъединицы и минимизирующих агрегацию. Чаще всего перед нанесением на гель белки подвергают диссоциации нагреванием с сильным анионным детергентом - натрия додецилсульфатом (ДСН). Денатурированные полипептиды связываются с ДСН, превращаясь в отрицательно заряженные частицы с постоянным отношением массы к заряду независимо от типа белка. Поскольку количество связанного ДСН почти всегда пропорционально молекулярной массе полипептида и не зависит от его последовательности, ДСН-полипептидные комплексы мигрируют в полиакриламидном геле со скоростью, зависящей от размера полипептида.

Электрофоретическая подвижность полученных детергент-полипептидных комплексов находится в функциональной взаимосвязи с их молекулярными массами. Миграция ДСН-комплексов происходит в направлении к аноду, при этом комплексы с низкими молекулярными массами движутся быстрее, чем с большими молекулярными массами. Следовательно, молекулярная масса белка может быть определена по его относительной подвижности в калиброванном ДСН-ПААГ, а наличие единичной полосы в геле является критерием чистоты белка.

Модификации полипептидной цепи, например, N- или O-связанное гликозилирование, приводят к значительному влиянию на кажущуюся среднюю молекулярную массу белка, поскольку ДСН не связывается с углеводным компонентом так же, как с полипептидным. В этом случае постоянное отношение заряда к молекулярной массе не сохраняется.

В зависимости от степени гликозилирования и других посттрансляционных модификаций средняя молекулярная масса белков не может быть истинным отражением массы полипептидной цепи.

Восстанавливающие условия. Полипептидные субъединицы и трехмерная структура белков часто поддерживаются благодаря присутствию дисульфидных связей. Цель анализа ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях состоит в том, чтобы разрушить структуру белков расщеплением дисульфидных связей. Полная денатурация и диссоциация белков обработкой 2-меркаптоэтанолом или дитиотреитолом (ДТТ) приводит к разворачиванию полипептидной цепи и последующему комплексообразованию с ДСН. В этих условиях молекулярную массу полипептидных субъединиц можно рассчитать методом линейной регрессии (для получения более точного результата - методом нелинейной регрессии) при использовании подходящих стандартов молекулярных масс.

Невосстанавливающие условия. Для ряда испытаний полная диссоциация белка на полипептидные субъединицы нежелательна. В отсутствие обработки восстанавливающими агентами, такими, как 2-меркаптоэтанол или ДТТ, дисульфидные ковалентные связи остаются неповрежденными и разделения на полипептидные субъединицы не происходит. Олигомерные ДСН-белковые комплексы мигрируют медленнее, чем их ДСН-полипептидные субъединицы. Кроме того, невосстановленные белки не могут быть целиком насыщены ДСН и, соответственно, поэтому не могут связывать детергент в постоянном массовом отношении. Дисульфидные связи внутри цепи укрепляют структуру полипептида, обычно посредством уменьшения гидродинамического радиуса молекулы, и таким образом уменьшая кажущуюся среднюю молекулярную массу. В связи с этим, определение молекулярной массы этих молекул с использованием ДСН-ПААГ является менее стандартизованным, чем анализ полностью денатурированных полипептидов, так как необходимо, чтобы и стандарты и анализируемые белки имели бы одинаковые конфигурации для достоверного сравнения.

5-1-3. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГЕЛЕ С ПРЕРЫВИСТОЙ БУФЕРНОЙ СИСТЕМОЙ (ДИСК-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ)

Наиболее широко применяемый электрофоретический метод исследования сложных белковых смесей, использует прерывистую буферную систему, включающую два смежных, но разных геля: разрешающий или разделяющий (нижний) гель и концентрирующий (верхний) гель. Эти два геля отличаются размерами пор, pH и ионной силой. Кроме того, используются разные по подвижности ионы в геле и электродных буферных растворах. Благодаря наличию прерывистости буферной системы происходит концентрирование больших объемов анализируемого образца в концентрирующем геле, что обеспечивает его наилучшее разрешение. После подключения источника тока перепад напряжения приводит к тому, что белки проникают в концентрирующий гель. Глицинат-ионы из электродного буферного раствора двигаются вслед за белками в концентрирующий гель. Быстро образуется область подвижной границы с высокоподвижными хлорид-ионами на переднем краю и относительно медленными глицинат-ионами на заднем. Образуется локализованный высоковольтный градиент между фронтами лидирующих и отстающих ионов, заставляя ДСН-белковые комплексы формировать тонкие зоны (диски) и мигрировать между фазами хлорида и глицината.

В широких границах, независимо от высоты нанесенного образца, все ДСН-белки концентрируются в очень узкую область и двигаются по направлению к разрешающему гелю в виде четко определенной тонкой зоны с высокой плотностью белка. Крупнопористый концентрирующий гель не задерживает миграцию большинства белков и, в основном, служит антиконвекционной средой. На границе раздела концентрирующего и разрешающего гелей происходит резкое возрастание эффекта задерживания белков вследствие ограниченного размера пор разрешающего геля и прерывистости буферного раствора, что также способствует фокусированию белков. Одновременно движение белков в разрешающем геле продолжает замедляться вследствие ситовых (разделяющих) свойств матрицы. Глицинат-ионы догоняют белки, которые далее передвигаются в пространстве с постоянным pH, образованным трис(гидроксиметил)аминометаном и глицином. Молекулярно-ситовые свойства фазы приводят к разделению ДСН-полипептидных комплексов в соответствии с их молекулярными массами.

5-1-4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВЕРТИКАЛЬНЫХ ПРЕРЫВИСТО-БУФЕРНЫХ ДСН-ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЕЙ

Данный раздел описывает приготовление гелей с использованием специального инструментария. Это не относится к сборным гелям. В случае применения предварительно приготовленных или любых других коммерчески доступных гелей и иного оборудования необходимо руководствоваться инструкциями производителя. Рекомендуется использовать коммерчески доступные реактивы, очищенные в растворе. В ином случае, а также при использовании недостаточно очищенных реактивов, проводят предварительную обработку. Например, раствор, имеющий такую степень загрязнения, что его необходимо фильтровать, должен быть также деионизирован с использованием ионообменной смолы смешанного типа (катионообменной/анионообменной) для удаления акриловой кислоты и других заряженных продуктов разложения. Растворы акриламида/бисакриламида и персульфат в твердом состоянии остаются стабильными в течение длительного периода при условии хранения в соответствии с рекомендациями.

Сборка кассет, формирующих гель. Две стеклянные пластинки (например, размером 10 см x 8 см), политетрафторэтиленовую гребенку, две прокладки и силиконовые трубки (например, диаметром 0,6 мм и длиной 35 см) моют с использованием мягких моющих средств и тщательно ополаскивают водой, а затем безводным этанолом и высушивают при комнатной температуре. Прокладки и трубки смазывают несиликоновым маслом. Прокладки укладывают вдоль двух коротких сторон стеклянных пластин на расстоянии 2 мм от их краев и 2 мм от длинной стороны, являющейся дном геля. Используя одну прокладку в качестве основы, начинают укладывать трубку. Осторожно загибают трубку к низу прокладки и протягивают вдоль длинной стороны стеклянной пластинки. Придерживая трубку вдоль длинной стороны пластинки, снова загибают трубку и протягивают ее по короткой стороне стеклянной пластинки, используя прокладку в качестве направляющей. Накрывают другой стеклянной пластинкой, плотно прижимая кассету руками. Устанавливают по два зажима на две короткие стороны кассеты. Осторожно устанавливают четыре зажима на длинную сторону кассеты геля, формируя дно кассеты. Необходимо удостовериться, чтобы трубка проходила вдоль края стеклянной пластинки и нигде не выдавливалась при размещении зажимов. Кассета готова для заливания гелем.

Приготовление геля. В случае приготовления прерывистого буферного ДСН-полиакриламидного геля рекомендуется сначала залить разделяющий гель, дождаться его полимеризации, а затем залить концентрирующий гель, поскольку гели различаются содержанием акриламида-бисакриламида, буферным раствором и pH.

Приготовление разделяющего геля. В конической колбе готовят соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования разрешающего геля, используя указания, приведенные в таблице 2.1.2.30.-1. Компоненты смешивают в указанной последовательности. При необходимости перед добавлением раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа раствор фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0,45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, взбалтывая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Затем добавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа, как указано в таблице 2.1.2.30.-1, взбалтывают и сразу заливают в пространство между двумя пластинками кассеты. Оставляют необходимое место для концентрирующего геля (длина зубцов гребенки плюс 1 см). Используя заостренную стеклянную пипетку, осторожно наслаивают насыщенный водой раствор изобутанола. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре до полимеризации геля.

Таблица 2.1.2.30.-1. - Приготовление разделяющего геля

--------------------------------

<1> Раствор акриламида: 30% раствор акриламид-бисакриламида (29:1) P.

<2> 1,5 МТрис (pH 8,8): 1,5 M буферный раствор трис-гидрохлорида pH 8,8 P.

<3> Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата P.

<4> Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата P. Благодаря аммония персульфату появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Так как раствор аммония персульфата быстро разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.

<5> ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин P.

Приготовление концентрирующего геля. После завершения полимеризации (около 30 мин) сливают изобутанол и промывают верхнюю поверхность геля несколько раз водой для удаления нанесенного изобутанола и неполимеризованных излишков акриламида. По возможности с верхней поверхности геля сливают воду, а затем удаляют остатки воды при помощи кончика бумажной салфетки.

В конической колбе готовят соответствующий объем раствора с необходимой концентрацией акриламида для формирования геля, используя значения, приведенные в таблице 2.1.2.30.-2. Компоненты смешивают в указанной последовательности. При необходимости перед добавлением раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа раствор фильтруют под вакуумом через ацетатцеллюлозную мембрану (диаметр пор 0,45 мкм); раствор выдерживают под вакуумом, встряхивая фильтрационное приспособление до окончания образования в растворе пузырьков. Прибавляют соответствующее количество раствора аммония персульфата и ТЕМЭДа, как указано в таблице 2.1.2.30.-2, взбалтывают и сразу заливают в пространство между двумя стеклянными пластинками кассеты прямо на поверхность ранее заполимеризованного разделяющего геля. Во избежание появления воздушных пузырьков в раствор концентрирующего геля сразу вставляют чистую политетрафторэтиленовую гребенку. Добавляют еще раствор концентрирующего геля до полного заполнения пространства между гребенкой и разделяющим гелем. Гель выдерживают в вертикальном положении при комнатной температуре до полимеризации геля.

Таблица 2.1.2.30.-2. - Приготовление концентрирующего геля

--------------------------------

<1> Раствор акриламида: 30% раствор акриламид/бисакриламида (29:1) P.

<2> МТрис (pH 6,8): 1 M буферный раствор трис-гидрохлорида pH 6,8 P.

<3> Раствор 100 г/л ДСН: раствор 100 г/л натрия додецилсульфата P.

<4> Раствор 100 г/л АПС: раствор 100 г/л аммония персульфата P. Благодаря аммония персульфату появляются свободные радикалы, ускоряющие полимеризацию акриламида и бисакриламида. Поскольку раствор аммония персульфата быстро разлагается, свежие растворы следует готовить ежедневно.

<5> ТЕМЭД: тетраметилэтилендиамин P.

Приготовление образцов. Если иное не указано в частной фармакопейной статье, образцы могут быть приготовлены приведенными ниже способами.

Приготовление образцов (невосстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси, состоящей из воды P и испытуемого препарата или препарата сравнения, и концентрированного буферного раствора для приготовления образцов при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P.

Приготовление образцов (восстанавливающие условия). Смешивают равные объемы смеси, состоящей из воды P и испытуемого препарата или препарата сравнения, и концентрированного буферного раствора для приготовления образцов в восстанавливающих условиях при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P, содержащего 2-меркаптоэтанол (или дитиотреитол) в качестве восстановителя.

Концентрация, указанная в частной фармакопейной статье, может варьировать в зависимости от белка и способа окрашивания.

Обработка образца: образец выдерживают в кипящей водяной бане в течение 5 мин или нагревательном блоке при температуре 100 °C, затем охлаждают. Температура и время, указанные в частной фармакопейной статье могут варьировать в связи с возможным разрушением белка, которое может произойти при термической обработке.

Установка геля в приборе для электрофореза и электрофоретическое разделение. После завершения полимеризации (около 30 мин) политетрафторэтиленовую гребенку осторожно удаляют. Лунки незамедлительно промывают водой или буферным рабочим раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P для удаления неполимеризованного акриламида. При необходимости выравнивают перегородки концентрирующего геля с помощью тупой иглы для подкожных инъекций, прикрепленной к шприцу. Снимают зажимы с одной короткой стороны, осторожно вытягивают трубку и возвращают зажимы на место. Повторяют эти операции с другой короткой стороны. Удаляют трубку со дна геля. Помещают гель в прибор для электрофореза. Верхний и нижний резервуары наполняют буферным раствором для электрофореза. Удаляют все пузырьки, образующиеся на дне геля между двумя стеклянными пластинками. Для этих целей лучше всего использовать изогнутую иглу, прикрепленную к шприцу. Не следует проводить первоначальный электрофорез до нанесения образцов, так как это приведет к нарушению прерывистости буферной системы. Перед нанесением образцов осторожно ополаскивают каждую лунку рабочим раствором для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия P. Готовят испытуемый и контрольный образцы в рекомендованном буферном растворе для образцов и обрабатывают, как указано в частной фармакопейной статье. Наносят необходимое количество каждого раствора в лунки концентрирующего геля.

Электрофорез проводят в условиях, рекомендованных производителем оборудования. Производители оборудования для ДСН-ПААГ могут предоставлять гели различной площади и толщины. Время проведения электрофореза и показатели ток/напряжение могут варьировать при достижении оптимального разделения. Необходимо удостовериться, что фронт красителя перемещается в разделяющий гель. Когда краситель доходит до нижнего края геля, электрофорез останавливают. Кассету с гелем вынимают из прибора и осторожно разделяют стеклянные пластины. Удаляют прокладки, отрезают и отбрасывают концентрирующий гель и немедленно начинают окрашивание оставшегося геля.

5-2. ДСН-ПААГ ГРАДИЕНТНЫЕ КОНТРАЦИОННЫЕ ГЕЛИ

Градиентные гели (разделяющие гели) готовят с увеличением концентрации акриламида в направлении сверху вниз. Для приготовления градиентных гелей требуется устройство для формирования градиента. Готовые градиентные гели доступны в продаже с использованием рекомендованных протоколов.

Градиентные гели обладают некоторыми преимуществами, так как они позволяют разделять белки, которые совместно мигрируют в гелях с фиксированной концентрацией акриламида. При электрофорезе белки мигрируют до тех пор, пока размер пор не препятствует их дальнейшему продвижению, и поэтому возникает эффект укладки, который приводит к появлению более резких полос. Как показано в таблице 2.1.2.30.-3, градиентные гели также позволяют разделять белки с более широким диапазоном молекулярных масс по сравнению с гелями с фиксированной концентрацией.

Таблица 2.1.2.30.-3. - Разделяющая способность гелей с градиентом концентрации.

В таблице приведены рекомендованные составы линейного градиента, с сопоставлением диапазона концентраций акриламида к соответствующим диапазонам молекулярных масс белка. Необходимо учитывать, что могут быть приготовлены другие формы градиента (например, вогнутая) для специального применения.

Градиентные гели также применяются для определения молекулярной массы и степени чистоты белка.

5-3. ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ В ГЕЛЯХ

Ниже детально описаны наиболее широко применяемые методы окрашивания белков красителем Кумасси и серебром. Коммерчески доступны также и другие красители, методы обнаружения и наборы. Например, флуоресцентные красители используются совместно с флуоресцентным устройством для получения изображений и часто обеспечивают линейную зависимость аналитического сигнала в широком диапазоне концентраций белка, часто в пределах нескольких порядков в зависимости от природы белка.

Окрашивание красителем Кумасси позволяет определять от 1 мкг до 10 мкг белков в одной полосе. Окрашивание серебром - более чувствительный метод окрашивания белков, при этом могут быть обнаружены полосы, содержащие от 10 нг до 100 нг белка. Эти цифры считаются реально достижимыми для данной окраски гелей. Иногда в литературе указывается чувствительность окрашивания серебром на 1 или 2 порядка выше.

Окрашивание красителем Кумасси обеспечивает более линейный сигнал, чем окрашивание серебром; тем не менее, сигнал и диапазон зависят от природы белка и времени проведения электрофоретического разделения. Воспроизводимость при окрашивании красителем Кумасси и серебром может уменьшаться, если окрашивание прекращают из субъективных соображений, то есть в момент, когда оно кажется достаточным. Очень важно использовать динамические диапазоны стандартных белков, так как они помогают оценить чувствительность и линейность при проведении испытания. Все стадии окрашивания гелем выполняются в одноразовых перчатках, при комнатной температуре, при осторожном перемешивании (например, на платформе орбитального шейкера) и с использованием любого удобного контейнера.

Окрашивание красителем Кумасси. Гель погружают в большой объем окрашивающего раствора Кумасси P, выдерживают в течение не менее 1 ч. Затем сливают окрашивающий раствор.

Гель обесцвечивают большим объемом отмывающего раствора P. Отмывающий раствор меняют несколько раз до четкого проявления белковых полос на прозрачном фоне. Чем тщательнее отмывают гель, тем меньшее количество белков можно найти этим методом. Обесцвечивание можно ускорить добавлением в отмывающий раствор P нескольких граммов анионообменной смолы или маленького кусочка пористого материала.

ПРИМЕЧАНИЕ. Кислотно-спиртовые растворы, используемые в указанной методике, не позволяют полностью фиксировать белки в геле. Это может привести к потерям некоторых низкомолекулярных белков в процессе окрашивания и обесцвечивания тонких гелей. Полная фиксация возможна при выдерживании геля в смеси трихлоруксусная кислота P - метанол P - вода P (1:4:5, об/об/об) в течение 1 ч перед погружением геля в окрашивающий раствор Кумасси P.

Окрашивание серебром. Гель погружают в большой объем фиксирующего раствора P и выдерживают в течение 1 ч. Фиксирующий раствор сливают, добавляют новую порцию фиксирующего раствора, выдерживают в течение не менее 1 ч или, если возможно, в течение ночи. Затем фиксирующий раствор сливают и гель промывают большим объемом воды P в течение 1 ч. Далее гель выдерживают в 1% растворе глутарового альдегида P (об/об) в течение 15 мин, дважды промывают большим объемом воды P, каждый раз в течение 15 мин, помещают в свежеприготовленный реактив серебра нитрата P и выдерживают в течение 15 мин в темном месте. Затем трижды промывают большим объемом воды P, каждый раз в течение 5 мин. Гель выдерживают в растворе проявителя P в течение около 1 мин до достаточного окрашивания. Проявление останавливают, помещая гель в блокирующий раствор P на 15 мин. Ополаскивают гель водой P.

5-4. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Гели фотографируют и сканируют пока они еще влажные или после соответствующей процедуры сушки. В настоящее время доступны системы для сканирования гелей, оснащенные программным обеспечением для анализа данных и позволяющие незамедлительно фотографировать и анализировать мокрые гели.

Гели обрабатывают в зависимости от используемого метода окрашивания. Окрашенные красителем Кумасси гели после стадии обесцвечивания выдерживают в растворе 100 г/л глицерина P в течение не менее 2 ч (возможно инкубирование в течение ночи). При окрашивании серебром на конечной стадии отмывания гели выдерживают в растворе 20 г/л глицерина P в течение 5 мин.

Высушивание окрашенных ДСН-полиакриламидных гелей является одним из методов, применяемых для долговременного документирования. Этот метод часто приводит к растрескиванию геля во время высушивания между целлюлозными пленками.

Два листа пористой целлюлозной пленки погружают в воду P и выдерживают в течение 5 - 10 мин. Растягивают один из листов пленки на рамке для высушивания, на натянутую целлюлозную пленку аккуратно помещают пропитанный в растворе гель, удаляют все случайно попавшие воздушные пузыри, заливают вокруг граней геля несколько миллилитров воды P, помещают второй лист пленки сверху и снова удаляют все воздушные пузыри, заканчивают сборку рамки для сушки геля и помещают ее в сушильный шкаф или оставляют при комнатной температуре до полного высыхания геля.

5-5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ

Молекулярные массы белков определяют, сравнивая их подвижность с подвижностью нескольких маркерных белков с известной молекулярной массой. Для калибровки гелей доступны смеси из предварительно окрашенных и неокрашенных белков с точно известными молекулярными массами, смешанными для равномерного окрашивания. Получены смеси для различных диапазонов молекулярных масс. Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буфером образца и наносят на тот же гель, что и испытуемый образец.

Сразу после проведения электрофореза отмечают положение полосы красителя бромфенолового синего, которая соответствует передней кромке электрофоретического ионного фронта. Это можно сделать нанесением надреза края геля или путем прокола геля в зоне окрашенного геля иглой, предварительно смоченной в черную тушь или другой подходящий контрастный краситель. После окрашивания геля измеряют пробег для каждой полосы белка (маркеров или испытуемого образца) от вершины разрешающего геля. Вычисляют отношение расстояние пробега каждого белка к расстоянию пробега, пройденного красителем. Нормализованные расстояния пробега, вычисленные таким образом, называются относительными подвижностями белков (относительно фронта красителя) и обозначаются, как RF. Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс (М.м.) белковых стандартных образцов от полученных значений RF. Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью метода линейной регрессии (для получения более точного результата - методом нелинейной регрессии) или интерполяцией кривых зависимости log Mr от RF, если значения, полученные для испытуемых образцов, располагаются на линейной части графика.

5-6. ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ

Результаты испытания признаются достоверными, если требуемый диапазон разрешения геля подтвержден распределением маркерных белков с известными молекулярным массами, например, на протяжении 80% длины геля. Разделение, полученное для маркерных белков, должно проявлять линейную зависимость логарифма молекулярной массы от RF. Если график имеет сигмовидную форму, то в расчетах могут быть использованы только данные участка линейной области кривой. В частной фармакопейной статье могут быть указаны дополнительные требования к валидации по отношению к испытуемому образцу.

Чувствительность также должна быть валидирована. Для проверки пригодности системы может применяться стандартный образец белка с концентрацией, соответствующей необходимому пределу, анализируемый параллельно с испытуемыми образцами.

5-7. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ

ДСН-ПААГ часто используется при проведении испытания на предельное содержание примесей. В случае, если содержание примесей определяется методом нормализации и по отношению к основной полосе с использованием денситометрического интегрирования или путем анализа изображений, линейность сигнала должна быть валидирована. Необходимо учитывать, что в зависимости от метода обнаружения, диапазон линейности может варьировать, но он должен быть определен при каждом испытании с использованием одного или более контрольных образцов, содержащих белки в подходящем диапазоне концентраций.

В тех случаях, когда предельное содержание примесей указано в частной фармакопейной статье, в испытании необходимо использовать раствор сравнения, соответствующий этому уровню содержания примеси, приготовленный разведением испытуемого раствора. Например, если предельное содержание примесей составляет 5%, необходимо приготовить раствор сравнения путем разведения испытуемого раствора в соотношении 1:20. На электрофореграмме с испытуемым раствором ни одна полоса, кроме основной, не должна быть интенсивнее полосы, полученной с раствором сравнения.

Для валидированной методики содержание примесей может быть количественно определено методом внутренней нормализации по отношению к основной полосе с использованием интегрирующего денситометра или путем анализа изображений. При валидации методики должна быть подтверждена линейность.

2.1.2.31. Потеря в массе при высушивании

Определение потери в массе при высушивании проводят одним из приведенных способов и выражают в процентах (м/м).

Методика. Указанное в частной фармакопейной статье количество испытуемого образца помещают во взвешенный бюкс, предварительно высушенный в условиях, описанных для испытуемого образца. Образец сушат в бюксе с открытой крышкой до постоянной массы одним из следующих ниже способов, при необходимости охлаждают в эксикаторе и взвешивают с закрытой крышкой бюкса. Если температурный интервал не указан, то высушивание проводят при указанной температуре +/- 2 °C.

Способ 1. Пробу высушивают в сушильном шкафу, проверку пригодности которого проводят в соответствии с установленными процедурами системы качества, например, с использованием подходящих сертифицированных стандартных образцов. Если в частной фармакопейной статье не указано иначе, высушивание проводят в течение 2 ч при 105 °C, затем открытый бюкс вместе с крышкой помещают в эксикатор для охлаждения на 50 мин, после чего закрывают крышкой и взвешивают. Последующие взвешивания проводят после каждого часа дальнейшего высушивания до достижения постоянной массы.

Способ 2. Высушивание проводят над фосфора (V) оксидом P одним из следующих методов:

- в эксикаторе при атмосферном давлении и комнатной температуре;

- в вакууме при давлении от 1,5 кПа до 2,5 кПа и комнатной температуре или температуре, указанной в частной фармакопейной статье или в нормативном документе по качеству;

- в "высоком вакууме": при давлении не более 0,1 кПа и температуре, указанной в частной фармакопейной статье или нормативной документации.

В случае использования иных условий, используемая методика полностью описывается в частной фармакопейной статье.

2.1.2.32. Осмоляльность

Осмоляльность - показатель, позволяющий оценить суммарный вклад различных растворенных веществ в осмотическое давление раствора.

Приближенный расчет осмоляльности водного раствора проводят по формуле:

где: - суммарное число ионов, образующихся из одной молекулы растворенного вещества в результате диссоциации. В случае если растворенное вещество не диссоциирует на ионы, = 1;

m - моляльность раствора, т.е. число моль растворенного вещества на килограмм растворителя;

Ф - моляльный осмотический коэффициент, учитывающий взаимодействие между ионами противоположного знака в растворе и зависящий от величины m. По мере усложнения состава раствора усложняется и определение величины Ф.

Единицей осмоляльности является осмоль на килограмм (осмоль/кг), но на практике обычно используется единица миллиосмоль на килограмм (мосмоль/кг).

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье осмоляльность определяют по понижению температуры замерзания раствора. Зависимость между осмоляльностью и понижением температуры замерзания выражают соотношением:

Прибор. Составными частями прибора (осмометра) являются:

- приспособление для охлаждения сосуда с измерительной ячейкой;

- система для измерения температуры, состоящая из чувствительного к температуре сопротивления (термистора) с соответствующим устройством для измерения тока или разности потенциалов. Измерительное устройство может быть откалибровано в градусах понижения температуры или непосредственно в единицах осмоляльности;

- как правило, приспособление для перемешивания образца.

Методика. Готовят стандартные растворы в соответствии с таблицей 2.1.2.32.-1. Устанавливают нулевое значение на шкале прибора, используя воду P. Проводят калибровку прибора, используя стандартные растворы: помещают соответствующие объемы стандартного раствора в измерительную ячейку и начинают охлаждение системы. Чтобы предотвратить переохлаждение, измерительное устройство, как правило, программируют на работу при температурах более низких, чем ожидаемое криоскопическое понижение температуры. Подходящее устройство указывает на достижение равновесия. Перед каждым измерением измерительную ячейку ополаскивают соответствующим стандартным раствором.

Таблица 2.1.2.32.-1. - Стандартные растворы для калибровки осмометра

Те же операции проводят с испытуемым раствором. При этом перед каждым измерением измерительную ячейку ополаскивают испытуемым раствором. Результаты либо непосредственно определяют по шкале прибора, либо рассчитывают по измеренному понижению температуры замерзания. Результаты считают достоверными, если полученное значение осмоляльности испытуемого раствора не выходит за пределы значений осмоляльности двух стандартных растворов, использованных для калибровки.

2.1.2.33. Электропроводность

Сила тока I (в амперах), протекающего через проводник, прямо пропорциональна приложенной электродвижущей силе E (в вольтах) и обратно пропорциональна сопротивлению проводника R (в омах):

Электрическая проводимость (ранее называемая удельной электропроводностью) раствора () является, по определению, величиной, обратной сопротивлению (). Сопротивление определяют как отношение напряженности электрического поля к плотности тока. Сопротивление R (Ом) проводника, имеющего площадь сечения S (см2) и длину L (см), рассчитывают по формуле:

Таким образом:

или

где L/S соответствует константе идеальной ячейки.

Единицей электрической проводимости в системе СИ является сименс на метр (См·м-1), На практике электрическую проводимость раствора выражают в сименсах на сантиметр (См·м-1) или в микросименсах на сантиметр (мкСм·см-1). Единицей сопротивления в системе СИ является ом-метр (Ом·м). На практике сопротивление раствора обычно выражают в ом-сантиметрах (Ом·см). При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье значения электрической проводимости или сопротивления приводят для стандартной температуры 25 °C.

Описание прибора и порядок проведения испытания, описанные ниже, пригодны для лабораторного измерения электрической проводимости, значения которой больше, чем 10 мкСм·см-1. Измерение электрической проводимости воды проводят, как описано в соответствующих частных фармакопейных статьях.

ПРИБОР

Принцип работы используемого прибора (кондуктометра или омметра) основан на измерении сопротивления столба жидкости между электродами погруженного измеряющего устройства (кондуктометрическая ячейка). Во избежание поляризации электродов прибор подключают к переменному току. Прибор также оснащен датчиком температуры и температурным компенсатором.

Кондуктометрическая ячейка содержит два платиновых электрода, каждый с площадью поверхности S, располагающихся параллельно один к другому на расстоянии L и покрытых платиновой чернью. Обычно оба электрода защищены стеклянной трубкой. Допускается использование других типов ячеек.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЯ

Определение константы ячейки

Выбирают кондуктометрическую ячейку, соответствующую свойствам и электрической проводимости испытуемого раствора. Чем выше предполагаемая электрическая проводимость, тем большей должна быть величина константы ячейки (низкая ). Обычно используют кондуктометрические ячейки с константами порядка 0,1 см-1, 1 см-1 и 10 см-1. Для проведения измерения используют сертифицированный стандартный образец, например, раствор калия хлорида, приемлемый для измерения. Значение электрической проводимости сертифицированного стандартного образца должно быть близким к предполагаемому значению электрической проводимости испытуемого раствора. Допускается использование других сертифицированных стандартных образцов, особенно для ячеек с константой порядка 0,1 см-1. Ячейку промывают несколько раз водой дистиллированной P и как минимум дважды сертифицированным стандартным образцом, используемым для определения константы кондуктометрической ячейки. Измеряют сопротивление кондуктометрической ячейки, используя сертифицированный стандартный образец при температуре 25 +/- 1 °C. Константа ячейки Kячейки (см-1) зависит от геометрической формы кондуктометрической ячейки и рассчитывается по формуле:

где: RССО - измеренное сопротивление в мегаомах;

KССО - электрическая проводимость сертифицированного стандартного образца в микросименсах на сантиметр.

Измеренное значение константы Kячейки кондуктометрической ячейки не должно отличаться от указанного значения более чем на 5%.

Если определение константы кондуктометрической ячейки проводят при температуре, отличающейся от указанной для сертифицированного стандартного материала, значение электрической проводимости рассчитывают по формуле:

где: кТ - значение электрической проводимости при другой температуре;

кТССО - значение электрической проводимости сертифицированного стандартного образца;

Т - температура, установленная для калибровки;

ТССО - температура, указанная для сертифицированного стандартного образца;

- температурный коэффициент для значения электрической проводимости сертифицированного стандартного образца; для калия хлорида = 0,021.

Определение удельной электрической проводимости испытуемого раствора

После калибровки прибора с использованием раствора сертифицированного стандартного образца, кондуктометрическую ячейку промывают несколько раз водой дистиллированной P и не менее двух раз испытуемым водным раствором. Последующие измерения проводят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи.

2.1.2.34. Спектроскопия в ближней инфракрасной области

Спектроскопия в ближней инфракрасной (БИК) области - метод с широкими и разнообразными применением в фармацевтическом анализе. Ближняя инфракрасная спектральная область охватывает диапазон длин волн от 780 нм до 2500 нм (диапазон волновых чисел от 12 800 см-1 до 4000 см-1). В спектрах БИК области представлены главным образом обертоны колебаний C-H, N-H, O-H и S-H и комбинации основных типов колебаний средней инфракрасной области. Они несут сложную химическую и физическую информацию, которая в большинстве случаев извлечена путем математической обработки данных. Полосы в БИК области значительно более слабые, чем полосы основных колебаний в средней ИК области, от которых они происходят. Так как абсорбционные способности в БИК области малы, излучение способно проникать в материал (включая твердые вещества) на несколько миллиметров. Кроме того, многие вещества, такие как стекло, являются относительно прозрачными в этой области длин волн.

В дополнение к стандартным процедурам отбора проб и проведению испытаний, измерения могут быть проведены на образцах in situ. Измерения в БИК области могут проводиться, как в автономном режиме (off-line), так и в поточном режиме (at-line, in-line, on-line) для производственно-аналитической технологии (PAT). Для целей идентификации может потребоваться использование подходящих хемометрических методов. Однако при соблюдении критериев специфичности для качественного метода, химическая идентификация или характеристика твердых тел становится возможна путем прямого сравнения необработанных или предварительно обработанных спектров испытуемого химического образца со спектром стандартного образца.

БИК спектроскопия имеет широкую область применения для химического, физического и процессного анализа, например:

Химический анализ:

- идентификация активных субстанций, вспомогательных веществ, готовых лекарственных форм, промежуточных продуктов производства, химического сырья и упаковочных материалов;

- квалификация активных субстанций, вспомогательных веществ, готовых лекарственных форм, промежуточных продуктов производства и упаковочных материалов, включая спектральное сравнение серий и оценку смены поставщика;

- количественное определение содержания активных субстанций в матрице образца, определение химических чисел, таких как гидроксильное число, определение абсолютного содержания воды, определение степени гидроксилирования, контроль содержания растворителей.

Физический анализ:

- кристаллическая форма и кристалличность, полиморфизм, сольваты, размер частиц;

- распадаемость, твердость;

- свойства пленок.

Производственный анализ:

- мониторинг производственных операций, например, синтеза, смешивания, высушивания, гранулирования и покрытия оболочкой с целью контроля производственного процесса;

- контроль и определение конечных точек.

На измерения в БИК области влияют многие химические и физические факторы, описанные ниже; воспроизводимость и релевантность результатов зависят от контроля этих факторов; измерения справедливы обычно только для конкретной модели калибровки.

ПРИБОР

Все измерения в БИК области основаны на прохождении светового излучения через или вглубь образца и измерении интенсивности (прошедшего или отраженного) луча. Спектрометры для измерений в БИК области имеют подходящий источник света (такой как высокостабильная кварцево-вольфрамовая лампа), монохроматор или интерферометр и детектор. Обычные монохроматоры представляют собой акустооптические перестраиваемые фильтры (АОЛФ), дифракционные решетки или призмы. Традиционно многие БИК спектрометры имеют однолучевое строение, хотя некоторые процессы приборов используют внутреннее сравнение и таким образом могут быть двулучевыми (например, приборы с диодной матрицей). Примерами материалов детектора являются кремний, свинца сульфид и индия-галлия арсенид. Примерами некоторых держателей образцов являются обычные держатели кювет, оптоволоконные зонды, погружные ячейки для пропускания, нейтральные боросиликатные флаконы и вращающиеся или подвижные держатели образца, Выбор прибора зависит от предполагаемого применения, особое внимание обращают на пригодность держателя образцов для соответствующего типа анализируемых образцов. Подходящие блоки по обработке данных и их оценке (например, программное обеспечение и компьютер) обычно являются частью системы.

В зависимости от способа измерения и прибора обычно выражают длину волны () в нанометрах (нм) либо волновое число (v) в обратных сантиметрах (см-1). Пересчет между нанометрами и обратными сантиметрами проводят по формуле:

МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЙ

Режим пропускания. Пропускание (T) является мерой снижения интенсивности излучения при данных длинах волн при прохождении излучения сквозь образец. Образец помещают в оптический луч между источником и детектором. Такое расположение применяется во многих традиционных спектрофотометрах. Полученный спектр может быть представлен непосредственно в виде графика зависимости пропускания (T) и/или поглощения (A) (ось y) от длины волны или волнового числа (ось x).

где: I - интенсивность падающего излучения;

I0 - интенсивность прошедшего излучения.

Режим диффузного отражения. Режим диффузного отражения основан на измерении отражения (R) - отношения интенсивности света, отраженного от образца (I) к интенсивности света, отраженного от фона или стандартной отражающей поверхности (Ir). В зависимости от химического состава и физических характеристик образца, БИК излучение может проникать на более или менее существенное расстояние вглубь образца, где может быть поглощено колебательными комбинациями и обертонами аналита, присутствующего в образце. Непоглощенное излучение отражается от образца на детектор. БИК спектр отражения обычно получают путем расчета и построением графика зависимости log10(1/R) (ось y) от длины волны или волнового числа (ось x).

где: I - интенсивность излучения, диффузно отраженного от образца;

I0 - интенсивность излучения, диффузно отраженного от фона или отраженного от поверхности сравнения.

Режим пропускания-отражения. Этот режим является комбинацией пропускания и отражения. При измерении пропускания-отражения (T*) используется зеркало или диффузная отражающая поверхность для отражения излучения, прошедшего сквозь образец, второй раз, удваивая, таким образом, оптический путь. Непоглощенное излучение отражается от образца на детектор,

где: IT - интенсивность прошедшего и отраженного излучения без образца;

I - интенсивность прошедшего и отраженного излучения, измеренная с образцом.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ/ПОДАЧА ОБРАЗЦА

Приготовление и подача образца могут варьировать в зависимости от режима измерения. Следующие требования являются обязательными для всех методик пробоподготовки:

- оптимизируют время измерения и число сканирований для оптимизации отношения сигнал/шум;

- находят наиболее подходящий режим измерения для предполагаемого применения (пропускание, диффузное отражение, пропускание-отражение);

- находят наилучшую ориентацию образца (например, для минимизации влияния присутствующего тиснения на таблетках);

- находят наиболее подходящее приспособление (например, ячейка пропускания или погружной зонд);

- оптимизируют длину пути в режимах пропускания и пропускания-отражения;

- находят подходящий спектроскопический фоновый стандартный образец;

- подтверждают, что фоновый стандартный образец не меняется во времени, а показания фона являются воспроизводимыми и стабильными с течением времени;

- при измерении движущихся материалов или образцов (для измерений, касающихся производственных процессов) важным является получение репрезентативного спектра (например, с помощью корректировки времени измерения, количества сканирований, сложения индивидуальных спектров или увеличения размера луча);

- проверяют сенсор на возможное засорение, например, от налипшего материала или загрязнения;

- должны быть обоснованы условия проведения измерения (время измерения, размер луча) в отношении минимального размера образца.

При контроле процесса производства в некоторых случаях является невозможным извлечение датчика для сбора справочных данных, получаемых от сравнительного фона; при этом необходимо предусмотреть различные варианты, включая внутреннее сравнение, измерение сравнительного фона с использованием второго детектора и другие. Прямое сравнение спектров возможно только при условии получения спектров относительно фона, обладающего аналогичными оптическими свойствами.

Режим пропускания. Измерение и расчет пропускания (T) зависит от фонового пропускания. Для определения фонового пропускания обычно используют воздух, полимерный диск, пустую кювету, используемый растворитель или, в специальных случаях, стандартный образец. Метод в основном применяется для исследования разведенных и неразведенных жидкостей, дисперсионных систем, растворов и твердых образцов (включая таблетки и капсулы). Для измерения пропускания твердых образцов необходимо использовать подходящие приспособления для образцов. Жидкие образцы исследуются либо в кюветах подходящей длины (обычно от 0,5 мм до 4 мм), прозрачных в БИК области, либо путем погружения оптико-волоконного зонда подходящей конфигурации.

Режим диффузного отражения. Данный режим обычно используется для твердых тел. Образцы исследуют непосредственно, либо с помощью подходящего устройства (например, держателя образца), либо путем прямого контакта с оптоволоконным зондом. При контроле процесса производства материалы могут контролироваться через полированное окошко (например, сапфировое) или с использованием оптоволоконного зонда. Должны быть приняты меры для обеспечения воспроизводимости условий измерения спектров от образца к образцу. Для получения базовой линии сканируется отраженное излучение фона, а затем измеряется отражение одного или нескольких исследуемых образцов. В качестве стандартной отражательной поверхности обычно используются керамика, термопластические смолы и золото. Могут использоваться и другие подходящие материалы.

Режим пропускания-отражения. Данный режим обычно используется для жидкостей, суспензий и прозрачных полимерных материалов. Отражатель размещается позади образца таким образом, чтобы удваивать оптический путь. Такая конфигурация может быть адаптирована для совместного использования одной и той же геометрии прибора для системы с отражателем и системы с оптико-волоконным зондом, когда источник излучения и детектор располагаются по одну сторону образца. Образец исследуется в кювете с зеркалом или подходящим диффузным отражателем, сделанным либо из металла, либо из инертного вещества (например, высушенного титана диоксида), которое не поглощает в БИК области. Жидкости также могут быть измерены с использованием in-line зондов пропускания-отражения.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА СПЕКТРАЛЬНЫЙ ОТКЛИК

Окружающая среда. При проведении испытаний должны учитываться температура и влажность окружающей среды.

Область контакта образца. Область контакта образца или конец зонда должны быть очищены перед проведением измерения. Аналогично, в in-line или on-line области контакта с образцом не должно быть значительного налипания продукта либо загрязнений, которые могли бы влиять на измерение.

Температура образца. Данный параметр важен при исследовании водных растворов и многих жидкостей, когда различие в несколько градусов может приводить к существенным изменениям спектра, которые могут иметь значительное влияние на анализ. Кроме того, температура играет важную роль при исследовании твердых образцов и порошков, содержащих воду.

Влага и остаточные растворители. Влага и остаточные растворители, присутствующие в образце, приводят к значительным полосам поглощения в БИК области.

Толщина образца. Толщина образца является известным источником спектральной изменчивости и должна учитываться и/или контролироваться, особенно при анализе таблеток и капсул в режиме пропускания. Для измерения прессованных порошков бесконечная толщина обычно достигается при глубине образца более 5 мм (например, во флаконе).

Оптические свойства образца. Для твердых материалов должны учитываться рассеивающие свойства, как поверхности, так и насыпной массы образца. Для записи спектров физически, химически или оптически неоднородных образцов для получения репрезентативного спектра образца может понадобиться увеличение пучка излучения, исследование большого количества образцов или вращение образца. Определенные факторы, такие как степень уплотнения или размер частиц порошков, а также характер поверхности могут вызывать значительные спектральные изменения.

Формы твердого состояния. На вибрационные спектры оказывают влияние различия в формах твердого состояния (полиморфные формы, гидраты, сольваты и аморфные формы). Следовательно, различные кристаллические формы, а также аморфные формы твердых тел можно отличить друг от друга на основании их БИК спектров. В случае наличия различных кристаллических форм, необходимо обеспечить, чтобы и калибровочные стандартные образцы имели распределение форм, подходящее для предполагаемого использования.

Возраст образца. Со временем физические, химические или оптические свойства образцов могут измениться. В зависимости от условий хранения твердые образцы могут абсорбировать или терять воду, а части аморфного вещества могут кристаллизоваться. Материалы, используемые для БИК калибровки, должны быть репрезентативны в отношении будущих образцов и вариабельности их матрицы.

ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ БИК СПЕКТРОВ

Перед разработкой классификации или калибровочной модели во многих случаях и, в частности, для спектров, получаемых в режиме отражения, может понадобиться некоторая форма предварительной математической обработки спектра. Это может быть сделано с целью, например, уменьшения вариабильности базовой линии, уменьшения воздействия известных помех, которые оказывают влияние на последующие математические модели, или для упрощения данных перед их использованием. В некоторых случаях спектры также могут быть нормализованы или скорректировано рассеяние, например, с использованием преобразования стандартного отклонения случайной величины с нормальным распределением. Предварительная спектральная обработка может включать, например, кадрирование, снижение шума и численный расчет производных спектра первого или второго порядка. Производные более высоких порядков использовать не рекомендуется ввиду увеличивающегося спектрального шума.

КОНТРОЛЬ ПАРАМЕТРОВ ПРИБОРА

Прибор эксплуатируют согласно инструкциям изготовителя и регулярно проводят предписанные проверки в соответствии с использованием прибора и его применением. Использование альтернативных способов проверки пригодности прибора применяемого в поточных режимах (on-line и in-line) должно быть научно обосновано. Например, использование стандартных образцов, встроенных в прибор или в отдельный канал/зонд для подтверждения надлежащей работы прибора (проверка практичности).

Перед сканированием образца может понадобиться проведение испытания пригодности системы, а также должны быть проверены характеристики прибора, оказывающие возможное влияние на результат измерения (обычно фотометрический шум и точность установки длин волн). Частота проведения каждой проверки работоспособности прибора должна основываться на оценке рисков с учетом типа прибора и условий окружающий его среды. Например, для приборов, эксплуатирующихся в неблагоприятных условиях окружающей среды с колебаниями температуры и влажности, могут потребоваться частые проверки работоспособности. Также необходимо учитывать случаи, когда измерительная система не может быть извлечена, например, in-line зонд или проточная кювета.

Некоторые элементы прибора могут быть выполнены по индивидуальному заказу, в таком случае необходима и адекватная проверка работоспособности.

Проверка и калибровка шкалы длин волн или волновых чисел (кроме прибора, оснащенного фильтром). Используемую шкалу длин волн, обычно в области между 780 нм и 2500 нм (от 12 800 см-1 до 4000 см-1) или в требуемой спектральной области, проверяют с помощью одного или более подходящих стандартных образцов для определения длин волн, которые имеют характеристические максимумы или минимумы в диапазоне используемых длин волн. Подходящими стандартными образцами являются например, метиленхлорид P, тальк P, лампы с референсными длинами волн или смесь оксидов редкоземельных металлов. Могут быть использованы и другие подходящие стандартные образцы. Снимают спектр и измеряют положения не менее 3 пиков, находящихся в рабочем диапазоне. Подходящие стандартные образцы оксидов редкоземельных металлов доступны от Национального Института Стандартов и Технологий (NIST). Приборы с Фурье-преобразователем имеют линейный диапазон частот, поэтому достаточно сертификации длины волны на одной частоте.

Проверка и калибровка фотометрической линейности. Проверка фотометрической линейности проводится с помощью набора стандартных образцов пропускания или отражения с известными процентными показателями пропускания или отражения. Для измерения отражения доступны стандарты полимеров легированных углеродом. Удостоверяются, что поглощение используемых материалов является подходящим для предполагаемого линейного рабочего диапазона методики. Первоначальные значения поглощения могут служить в качестве стандартных значений при последующих проверках фотометрической линейности. Модели нелинейных калибровок и, следовательно, нелинейные отклики являются допустимыми при демонстрации пользователем понимания данного процесса.

Спектры стандартных образцов отражения и пропускания подвержены вариабельности вследствие различий экспериментальных условий, в которых производилась их заводская калибровка, и условиями, в которых они впоследствии использовались. Поэтому процентные значения коэффициентов отражения, предоставляемые вместе с набором калибровочных стандартных образцов, могут быть не применимы для получения "абсолютной" калибровки конкретного прибора. Однако при условии отсутствия изменений физических или химических свойств стандартных образцов и использования такого же фонового материала сравнения, как и при получении сертифицированных значений, последующие измерения этих стандартных образцов при идентичных условиях, включая точное положение пробы, используются для оценки периода сохранения стабильности фотометрического отклика. Отклонение +/- 2% от значения поглощения является приемлемым для длительной стабильности; данная проверка необходима только в случае использования спектров без предварительной обработки.

В таблице 2.1.2.34.-1 приведены рекомендованные условия для проверки пригодности прибора для различных режимов измерения.

Таблица 2.1.2.34.-1. - Проверка пригодности прибора

Таблица 2.1.2.34.-1. - (продолжение)

Таблица 2.1.2.34.-1. - (окончание)

--------------------------------

<1> Проверка фотометрической линейности и Проверка фотометрического шума не требуется для приборов, использующихся для простых испытаний на подлинность, для которых фотометрическое поглощение не используется как часть стратегии моделирования (например, простая корреляция с поглощающими длинами волн).

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА)

Создание библиотеки стандартных спектров. Снимают спектры подходящего количества репрезентативных образцов известного вещества с прослеживаемыми свойствами и типичной изменчивостью (например, по форме твердого тела, размеру частиц и т.п.). Библиотеки создаются с использованием репрезентативных образцов в подходящих условиях окружающей среды. Набор полученных спектров представляет собой информацию, которая может быть использована для идентификации анализируемого образца.

Коллекция спектров в библиотеке может быть представлена различными способами, определяемыми математическим методом, используемым для идентификации. Такими способами могут быть:

- все индивидуальные спектры, представляющие вещество;

- усредненный спектр измеренных серий для каждого химического вещества;

- при необходимости, описание изменчивости в спектрах вещества.

Количество спектров веществ в библиотеке зависит от ее специфического применения. Все спектры в используемой библиотеке должны иметь одинаковые:

- спектральный диапазон и количество исходных точек;

- технику измерения;

- предварительную обработку данных.

Если создаются подгруппы (подбиблиотеки), то для каждой группы независимо применяются вышеупомянутые критерии. Подбиблиотеки валидируют индивидуально. Исходные спектральные данные для подготовки библиотеки спектров должны быть архивированы. При любом математическом преобразовании следует соблюдать осторожность, так как в данные могут быть внесены артефакты или может быть потеряна существенная информация (необходимая для методов квалификации). Пригодность используемого алгоритма должна быть подтверждена успешной валидацией методики, и во всех случаях необходимо дать рациональное обоснование использования математического преобразования.

Прямое сравнение спектров испытуемого вещества и стандартного образца. Если позволяет специфичность, для целей качественной химической или физической идентификации использование спектральной библиотеки сравнения может не требоваться.

Оценка данных. Проводится прямое сравнение спектра испытуемого вещества с индивидуальным или средним стандартным спектром всех веществ в базе данных на основе их математической корреляции или других соответствующих алгоритмов. В алгоритме, применяющемся для целей идентификации, может быть использован набор известных средних стандартных спектров и изменчивость этих средних спектров; кроме того, можно добиться визуального сравнения путем наложения спектральных данных если присутствует специфичность. Существуют различные алгоритмы, такие как анализ главных компонентов, кластерный анализ, мягкое независимое моделирование по аналогии классов. Надежность методики, выбранной для конкретного использования, должна быть валидирована.

Валидация модели. Методики идентификации с использованием прямого сравнения спектров должны быть валидированы в соответствии с процедурами валидации методики идентификации. Для качественных методик валидационными характеристиками являются робастность и специфичность.

АНАЛИЗ ПРЕДЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ

Относительное сравнение спектров. Для целей такого анализа предельного содержания, как максимальная или минимальная оптическая плотность, при которых поглощает аналит, когда происходит сравнение спектров, калибровка не требуется. Кроме того, для контроля конечной точки сушки, в пределах специфичных длин волн поглощения, может быть использован подход, как в качественном анализе. Необходимо продемонстрировать пригодность спектрального диапазона и предварительной обработки данных (при ее использовании) для намеченных целей.

Специфичность. Для предельного испытания должна быть продемонстрирована относительная отличительная способность. Объем испытаний по определению специфичности зависит от применения и контролируемых рисков. Изменчивость в концентрациях матрикса в пределах рабочего диапазона не должна оказывать влияние на измерение.

АНАЛИЗ ТРЕНДОВ

Относительное сравнение спектров. Калибровка не обязательна при сравнении спектров с целью анализа трендов, таких как подход подвижного блока для расчета статистических параметров, таких как среднее, медианное и стандартное отклонение. Например, для контроля однородности смеси с использованием БИК спектроскопии принят такой метод анализа данных. Для анализа трендов должны использоваться подходящие спектральные диапазоны и алгоритмы.

Специфичность. Должна быть продемонстрирована относительная отличительная способность анализа трендов. Объем испытаний по определению специфичности зависит от применения и контролируемых рисков. Изменчивость в концентрациях матрикса в пределах рабочего диапазона не должна оказывать влияние на анализ трендов.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Создание библиотеки спектров сравнения для калибровочной модели. Калибровка - процесс построения математической модели, связывающей отклик, полученный при сканировании образца аналитическим прибором, со свойствами образцов. Может использоваться любая модель калибровки, которая может быть ясно описана точным математическим выражением и обеспечивает получение соответствующих результатов. Регистрируют спектры соответствующего количества репрезентативных образцов с известными или впоследствии устанавливаемыми значениями показателя (например, содержание воды) по всему измеряемому диапазону. Количество образцов для калибровки будет зависеть от сложности матрицы образца и оказываемых воздействий (например, температура, размер частиц и т.п.). Все образцы должны давать количественные результаты в пределах калибровочного интервала, определенного в соответствии с предполагаемым назначением методики. Обычно используются модель множественной линейной регрессии, регрессия главных компонент и метод частных наименьших квадратов. Для калибровочных моделей, полученных методом регрессии главных компонент и методом частных наименьших квадратов, по коэффициентам регрессии и/или весовым коэффициентам можно построить график и области наибольших коэффициентов или весовых коэффициентов сопоставить со спектром аналита. Диаграммы расчетной остаточной ошибки суммы квадратов способствуют оптимизации числа факторов метода регрессии главных компонент и метода частных наименьших квадратов.

Предварительная обработка данных. Выбор длины волны или исключение некоторых диапазонов длин волн могут увеличить правильность и робастность калибровочных моделей. К данным может быть применено сжатие длин волн (усреднение длин волн).

Параметры валидации модели. Валидационные характеристики методик на основе спектроскопии в БИК области, аналогичны параметрам валидации любой другой аналитической методики. Специфические критерии приемлемости для каждого параметра валидации должны соответствовать предполагаемому назначению методики. Для количественных методик валидационными характеристиками являются правильность, линейность, прецизионность (сходимость и внутрилабораторная прецизионность), робастность и специфичность.

ПОСЛЕДУЮЩАЯ ОЦЕНКА МОДЕЛИ

Валидированные для использования БИК модели подлежат последующей регулярной оценке пригодности и мониторингу параметров валидации.

ПЕРЕНОС БАЗ ДАННЫХ

При переносе баз данных на другой прибор должны быть учтены спектральный диапазон, количество экспериментальных точек, спектральное разрешение и другие параметры. Для демонстрации того, что модель остается пригодной для новой базы данных или нового прибора, в дальнейшем должны быть предусмотрены процедуры и установлены соответствующие критерии.

2.1.2.35. Общий органический углерод в воде для фармацевтического применения

Определение содержания общего органического углерода (ООУ) является косвенным методом определения содержания органических веществ в воде для фармацевтического применения. Определение содержания ООУ может также использоваться при контроле выполнения различных операций в производстве лекарственных средств.

Поскольку для определения содержания ООУ могут применяться различные методики, в данной общей фармакопейной статье приведены не описания методик, а их квалификация и интерпретация результатов в предельных испытаниях. Испытания раствора сравнения проводят через определенные интервалы времени в зависимости от частоты измерений; раствор готовят с использованием легкоокисляющейся субстанции (например, сахарозы) с такой концентрацией, чтобы сигнал прибора соответствовал измеряемому пределу содержания ООУ. Пригодность системы проверяют с использованием трудноокисляющейся субстанции (например, 1,4-бензохинона).

Разные типы приборов для определения ООУ в воде для фармацевтического применения, как правило, предназначены для полного окисления органических молекул в образце воды до углерода диоксида с последующим измерением его количества, используемого затем для расчета концентрации углерода в воде.

Используемый прибор в процессе работы должен различать органический углерод и неорганический углерод, который присутствует в виде карбонатов. Это может обеспечиваться путем определения количества неорганического углерода и вычитанием его из количества общего углерода или удалением неорганического углерода из образца при помощи продувания перед окислением. В процессе продувания из испытуемого образца могут удаляться и органические молекулы, но часть связанного с ними углерода в воде для фармацевтического применения незначительна.

Прибор. Используют откалиброванный прибор, установленный в режим "on-line" или "off-line". Пригодность системы проверяют, как описано ниже, через определенный промежуток времени. Прибор должен иметь предел обнаружения углерода 0,05 мг/л или менее, соответственно паспорту изготовителя прибора.

Вода для определения содержания ООУ. Используют воду высокоочищенную, соответствующую следующим требованиям:

- электропроводность не более 1,0 мкСм·см-1 при температуре 25 °C;

- содержание общего органического углерода: не более 0,1 мг/л.

В зависимости от типа используемого прибора критическим параметром может быть также содержание в воде тяжелых металлов или меди, что должно быть указано в инструкции изготовителя прибора.

Подготовка посуды. Используют посуду, тщательно вымытую с помощью метода, позволяющего удалить органические вещества. Для последнего промывания используют воду для определения содержания ООУ.

Раствор сравнения. Сахарозу P, предварительно высушенную при температуре 105 °C в течение 3 ч, растворяют в воде для определения содержания ООУ, получая раствор, содержащий 1,19 мг/л сахарозы (0,50 мг/л углерода).

Испытуемый раствор. Испытуемую воду собирают, исключая минимальное воздушное пространство, в воздухонепроницаемый контейнер, используя все возможные меры для предотвращения загрязнения. Испытание проводят с минимальной задержкой по времени с целью уменьшения возможного загрязнения воды от контейнера и его укупорочного материала.

Раствор для проверки пригодности системы. Готовят раствор 0,75 мг/л 1,4-бензохинона P в воде для определения содержания ООУ (0,50 мг/л углерода).

Контрольная вода для определения содержания ООУ. Используют воду для определения содержания ООУ, полученную одновременно с водой для приготовления раствора сравнения и раствора для проверки пригодности системы.

Контрольные растворы. Кроме контрольной воды для определения содержания ООУ готовят подходящие контрольные растворы или другие растворы, необходимые для восстановления базовой линии или корректирования калибровки в соответствии с инструкцией изготовителя прибора; используя контрольные растворы, устанавливают ноль прибора.

Проверка пригодности системы. Проводят испытания указанных растворов и записывают сигналы прибора: вода для определения содержания ООУ, раствор сравнения, раствор для проверки пригодности системы. Эффективность сигналов, в процентах, рассчитывают по формуле:

где: rw - сигнал прибора для воды для определения содержания ООУ;

rs - сигнал прибора для раствора сравнения;

rss - сигнал прибора для раствора для проверки пригодности системы.

Система считается пригодной, если эффективность сигнала прибора составляет не менее 85% и не более 115% от теоретического сигнала.

Методика. Записывают сигнал (ru) для испытуемого раствора. Испытуемый раствор выдерживает испытание, если значениене ru превышает значение .

Данная методика может быть выполнена в режиме "on-line" на приборе, который соответствующим образом откалиброван и соответствует требованиям пригодности системы. Выбранное место расположения прибора должно обеспечивать репрезентативность показаний прибора в отношении используемой воды.

2.1.2.36. Хроматографические методы разделения

Хроматографическими называют многостадийные методы разделения, в которых компоненты образца распределяются между двумя фазами (неподвижной и подвижной). Неподвижная фаза может быть твердым веществом, жидкостью, нанесенной на твердый носитель, или гелем. Неподвижная фаза может помещаться в колонку, наноситься в виде тонкого слоя или пленки и т.д. Подвижная фаза может быть газом, жидкостью или сверхкритическим газом (флюидом). Разделение может быть основано на адсорбции, распределении (разделении) масс, ионном обмене и т.д. или на различиях в физико-химических свойствах молекул, таких, как размер, масса, объем и т.д.

Данный раздел содержит определения и расчеты общих параметров и применимых ко всем хроматографическим методам требований для пригодности системы. Принципы разделения, описание приборов и методик приводятся в следующих общих статьях:

- Бумажная хроматография (2.1.2.25);

- Тонкослойная хроматография (2.1.2.26);

- Газовая хроматография (2.1.2.27);

- Высокоэффективная жидкостная хроматография (2.1.2.28);

- Эксклюзионная хроматография (2.1.2.29);

- Сверхкритическая флюидная хроматография.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для установления пригодности хроматографической системы и расчета критериев приемлемости в частных фармакопейных статьях использованы приведенные ниже определения. Ряд параметров (например, отношение сигнал/шум и разрешение) может быть рассчитан с помощью программного обеспечения, предоставляемого производителем используемого оборудования. Обеспечение соответствия способов расчета, используемых в программном обеспечении, требованиям Фармакопеи и внесение необходимых поправок в случае их несоответствия входит в ответственность пользователя.

Хроматограмма - (графическое или иное представление зависимости сигнала детектора, цвета и интенсивности зон, концентрации веществ в элюате или другой количественной величины, используемой для измерения концентрации веществ в элюате, от времени, объема или расстояния. В идеале хроматограммы представляют собой последовательность гауссовых пиков, расположенных на базовой линии (рисунок 2.1.2.36.-1).

Рисунок 2.1.2.36-1. - Схематическое изображение хроматограммы.

Пик - участок хроматограммы с записанным сигналом детектора при элюировании из колонки одного компонента (или двух и более неразделенных компонентов).

Пик может быть охарактеризован площадью пика, или высотой пика (h) и шириной пика на половине высоты (wh), или высотой пика (h) и шириной пика между точками перегиба (wi). Для гауссовых пиков (рисунок 2.1.2.36.-1) выполняется соотношение:

Зона адсорбции - часть хроматографической пластинки, содержащая адсорбированное определяемое вещество и визуализируемая в виде пятна (круглого или эллипсовидного) или полосы.

Время удерживания (tR) - время, необходимое для элюирования компонента (рисунок 2.1.2.36.-1, шкала базовой линии в минутах).

Объем удерживания (VR) - объем подвижной фазы, необходимый для элюирования компонента. Объем удерживания может быть рассчитан по времени удерживания и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

"Мертвое" время (tM) - время, необходимое для элюирования неудерживаемого компонента (рисунок 2.1.2.36.-1, шкала базовой линии в минутах). В эксклюзионной хроматографии используют символ t0 (см. ниже).

"Мертвый" объем (VМ) - объем подвижной фазы, необходимый для элюирования неудерживаемого компонента. "Мертвый" объем может быть рассчитан по "мертвому" времени и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

В эксклюзионной хроматографии используют символ V0 (см. ниже).

Коэффициент удерживания (k) - характеристика, определяемая по формуле:

где: KС - константа распределения (известная также как коэффициент равновесного распределения);

Vs - объем неподвижной фазы;

VМ - объем подвижной фазы.

Коэффициент удерживания компонента может быть определен из хроматограммы по формуле:

Общее время подвижной фазы (ti) - время удерживания компонента, молекулы которого меньше, чем размер наименьшей поры геля в эксклюзионной хроматографии (известное также как полное время эксклюзии) (рисунок 2.1.2.36.-2).

Рисунок 2.1.2.36.-2 - Временные/объемные показатели хроматограмм.

Полный объем эксклюзии (Vt) - объем удерживания компонента, молекулы которого меньше, чем размер наименьшей поры геля в эксклюзионной хроматографии. Полный объем эксклюзии может быть рассчитан по общему времени подвижной фазы и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

Время удерживания неудерживаемого компонента (t0) - время удерживания компонента, молекулы которого больше, чем размер наибольшей поры геля в эксклюзионной хроматографии (рисунок 2.1.2.36.-2).

Объем удерживания неудерживаемого компонента (V0) - объем удерживания компонента, молекулы которого больше, чем размер наибольшей поры геля в эксклюзионной хроматографии. Объем удерживания неудерживаемого компонента может быть рассчитан по времени удерживания неудерживаемого компонента и скорости подвижной фазы (F) (в миллилитрах в минуту) по формуле:

Константа распределения (K0) - характеристика элюентных свойств компонента в определенной колонке в эксклюзионной хроматографии, рассчитываемая по формуле:

Коэффициент замедления (RF) - характеристика относительной скорости перемещения компонента в тонком слое (известная также как коэффициент удерживания (Rf) в плоскостной хроматографии). Коэффициент замедления равен отношению расстояния от точки нанесения пробы до центра зоны адсорбции и расстояния, пройденного фронтом растворителя от точки нанесения пробы (рисунок 2.1.2.36.-3):

где: b - расстояние, пройденное компонентом;

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

Рисунок 2.1.2.36.-3 - Схематическое изображение тонкослойной хроматограммы. A - фронт подвижной фазы; B - пятно; C - линия нанесения пробы (линия старта).

Число теоретических тарелок (N) - характеристика эффективности (кажущейся эффективности) колонки. Число теоретических тарелок может быть рассчитано по данным, полученным в зависимости от методики как при изотермическом или изократическом режимах, так и режиме постоянной плотности по формуле, в которой величины tR и wh должны быть выражены в одинаковых единицах:

где: tR - время удерживания пика компонента;

wh - ширина пика на половине его высоты.

Число теоретических тарелок зависит как от компонента, так и используемой колонки и ее температуры, а также от подвижной фазы и времени удерживания.

Объем задержки (D) - объем между точкой, при которой происходит смешение элюентов, и входом в колонку (известный также как объем задержки градиента). Объем задержки может быть определен в приведенных ниже условиях хроматографирования.

Колонка: хроматографическую колонку заменяют подходящей капиллярной трубкой (например, длиной 1 м и внутренним диаметром 0,12 мм);

Подвижная фаза:

- подвижная фаза A: вода P;

- подвижная фаза B: 0,1% (об/об) раствор ацетона P;

Скорость подвижной фазы: устанавливают до достаточного обратного давления (например, 2 мл/мин);

Детектирование: спектрофотометр, при длине волны 265 нм,

Определяют время (t0,5) (в минутах), при котором оптическая плотность увеличивается на 50% (рисунок 2.1.2.36.-4).

Рисунок 2.1.2.36.-4. - Определение объема градиентной задержки.

где: tD - t0,5 - 0,5tG (в минутах);

tG - предварительно установленное время градиента (равное 20 мин);

F - скорость подвижной фазы (в миллилитрах в минуту).

Коэффициент симметрии (As) - характеристика симметричности пика, (рисунок 2.1.2.36.-5), рассчитываемая по формуле:

где: w0,05 - ширина пика на одной двадцатой его высоты;

d - расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передней границей пика на одной двадцатой его высоты.

Рисунок 2.1.2.36.-5. - Схематическое изображение пика с растянутым задним фронтом.

Значение As, равное 1,0, означает полную симметрию. Если As > 1,0, пик имеет растянутый задний фронт ("хвост"); если As < 1,0, пик имеет растянутый передний фронт.

Разрешение (Rs) - характеристика степени разделения между пиками двух компонентов (рисунок 2.1.2.36.-6), которая может быть рассчитана по формуле:

где: tR2 > tR1

tR1 и tR2 - времена удерживания пиков;

wh1 и wh2 - ширина пиков на половине высоты.

Рисунок 2.1.2.36.-6. - Схематическое изображение неразделившихся пиков.

В количественной плоскостной хроматографии с использованием денситометрии вместо времен удерживания используют пройденные расстояния, и разрешение между пиками двух компонентов рассчитывают по формуле:

где: RF1 и RF2 - коэффициенты замедления пиков;

wh1 и wh2 - ширина пиков на половине их высоты;

a - расстояние, пройденное фронтом растворителя.

Отношение пик/впадина (p/v) - характеристика, используемая в качестве критерия пригодности хроматографической системы в испытании на родственные примеси, когда разделение двух пиков до базовой линии не достигнуто (рисунок 2.1.2.36.-7). Отношение пик/впадина рассчитывают по формуле:

где: Hp - высота меньшего пика относительно экстраполированной базовой линии;

Hv - высота над экстраполированной базовой линией наиболее низкой точки кривой, разделяющей меньший и больший пики.

Рисунок 2.1.2.36.-7. - Схематическое изображение параметров для расчета отношения сигнал/шум.

Относительное удерживание (r) (характеристика, рассчитываемая по формуле:

где: tRi - время удерживания пика определяемого компонента;

tRst - время удерживания пика сравнения (обычно пик испытуемого вещества);

tМ - "мертвое" время.

Неоткорректированное относительное удерживание (rG) рассчитывают по формуле:

При отсутствии других указаний значения относительного удерживания, указанные в частных фармакопейных статьях, соответствуют неоткорректированному относительному удерживанию.

В плоскостной хроматографии вместо tRst и tRi используют коэффициенты замедления RSt и RFi. Полученное значение является коэффициентом RSt.

Отношение сигнал/шум (S/N) - характеристика влияния кратковременного шума на прецизионность количественного определения. Отношение сигнал/шум рассчитывают по формуле:

где: H - высота пика (рисунок 2.1.2.36.-7) рассматриваемого компонента на хроматограмме указанного раствора сравнения; высоту измеряют от максимума пика до экстраполированной базовой линии сигнала, наблюдаемого на расстоянии, равном не менее пятикратной ширине пика на половине его высоты;

h - область фонового шума на хроматограмме, полученной при введении или нанесении контрольного раствора, наблюдаемая на расстоянии, равном не менее пятикратной ширине пика на половине высоты пика на хроматограмме указанного раствора сравнения, и, по возможности, расположенная по обе равные стороны от места возможного обнаружения пика.

Повторяемость системы - характеристика сигнала, выражаемая в виде рассчитанного относительного стандартного отклонения в процентах (sr (%)) последовательных серий измерений для не менее трех введений или нанесений раствора сравнения и рассчитываемая по формуле:

где: y1 - индивидуальные значения площади пика, высоты пика или отношения площадей в методе внутреннего стандарта;

- среднее индивидуальных значений;

n - число индивидуальных значений.

Неучитываемый предел - предел, при котором и ниже которого пики не учитываются.

ПРИГОДНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Различные части применяемого оборудования должны быть квалифицированы и способны к достижению уровня функционирования, необходимого для проведения испытания или количественного определения.

Испытания пригодности системы являются неотъемлемой частью методики и используются для обеспечения надлежащего функционирования хроматографической системы. Для оценки работы колонки обычно используют следующие параметры: кажущаяся эффективность, коэффициент удерживания (коэффициент распределения масс), разрешение и коэффициент симметрии.

На хроматографическое поведение могут влиять следующие факторы:

- состав, ионная сила, температура и кажущийся pH подвижной фазы;

- скорость подвижной фазы, размеры колонки, температура колонки и давление;

- характеристика неподвижной фазы, в том числе тип хроматографического носителя (состоящий из частиц, или монолитный), размер частиц или макропор, пористость, удельная площадь поверхности;

- химическая модификация поверхности неподвижной фазы (обращенно-фазовая и другие модификации), степень химической модификации (блокирование концевых групп, т.е. эндкепирование), содержание углерода в процентах и т.д.).

При отсутствии других указаний должны выполняться следующие требования и любые другие дополнительные требования, приведенные в частной фармакопейной статье:

- при испытании на родственные примеси и количественном определении величина коэффициента симметрии пика, полученного на хроматограмме раствора сравнения, используемого для количественных расчетов, должна находиться в пределах от 0,8 до 1,5 при отсутствии других указаний;

- при количественном определении действующего вещества при значении 100% для чистого вещества, максимально допустимое относительное стандартное отклонение (sr (%)) для заданных пределов рассчитывают из серии введений раствора сравнения по формуле:

где: K - константа (0,349), полученная из уравнения , в котором соответствует значению относительного стандартного отклонения (в процентах) при шести повторных вводах пробы для B = 1,0;

B - верхний предел количественного содержания, указанный в частной фармакопейной статье, минус 100%;

n - число повторных вводов раствора сравнения (3 <= n <= 6);

t90%,n-1 - коэффициент Стьюдента t при доверительной вероятности 90% в двустороннем интервале с числом степеней свободы n - 1.

При отсутствии других указаний, максимально допустимое относительное стандартное отклонение не должно превышать соответствующих значений, приведенных в таблице 2.1.2.36.-1. Данное требование не распространяется на испытания на родственные примеси - в испытании на родственные примеси предел количественного содержания (соответствующий отношению сигнал/шум, равному 10) должен быть равен или меньше неучитываемого предела.

Таблица 2.1.2.36.-1. - Требования к повторяемости

Соответствие требованиям пригодности системы должно поддерживаться в течение всего процесса хроматографирования. В зависимости от различных факторов, таких как частота использования методики, опыта работы с хроматографической системой, аналитик подбирает подходящую схему проверки для контроля данного соответствия.

РЕГУЛИРОВАНИЕ УСЛОВИЙ ХРОМАТОГРАФИРОВАНИЯ

Ниже приведены пределы, в которых могут корректироваться различные параметры хроматографических испытаний для соответствия критериям пригодности хроматографической системы без принципиального изменения методики.

Регулирование условий хроматографирования с градиентным элюированием является более критичным, чем с изократическим элюированием, так как может вызвать сдвиг пиков на различных уровнях градиента, и, таким образом, привести к некорректному установлению пиков, маскированию пиков или к такому их смещению, при котором элюирование будет происходить за пределами указанного времени элюирования.

Изменения, отличные от указанных, требуют ревалидации методики. Описанные условия хроматографирования должны быть валидированы при разработке частной фармакопейной статьи.

Проверку пригодности хроматографической системы включают с целью подтверждения достижения степени разделения, необходимой для надлежащего проведения испытания или количественного определения. Тем не менее, поскольку неподвижные фазы описаны в общем виде и существует широкое разнообразие доступных в продаже фаз, отличающихся хроматографическим поведением, может потребоваться некоторое корректирование условий хроматографирования для выполнения указанных требований пригодности системы. В частности, в методиках обращенно-фазовой хроматографии корректирование различных параметров не всегда приводит к удовлетворительному разделению. В данном случае может быть необходимой замена колонки другой однотипной колонкой (например, силикагель октадецилсилильный), проявляющей требуемое хроматографическое поведение.

Корректирование критических параметров для обеспечения пригодности системы четко указывают в частной фармакопейной статье.

Тонкослойная и бумажная хроматография

Состав подвижной фазы: содержание компонента-растворителя, присутствующего в меньшем количестве, может корректироваться в пределах +/- 30% (относительное содержание) или +/- 2% (абсолютное содержание), в зависимости от того, что из них больше. Например, для меньшего по содержанию компонента, составляющего 10% подвижной фазы, корректирование относительного содержания на 30% допускает предельные значения от 7% до 13%, а корректирование абсолютного содержания на 2% допускает предельные значения от 8% до 12%, т.е. корректирование по относительному содержанию больше. Для меньшего по содержанию компонента, составляющего 5% подвижной фазы, корректирование относительного содержания на 30% допускает предельные значения от 3,5% до 6,5%, а корректирование абсолютного содержания на 2% допускает предельные значения от 3% до 7%, т.е. в данном случае корректирование по абсолютному содержанию больше. Абсолютное содержание других компонентов не может быть изменено более чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: +/- 0,2 pH при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье или +/- 1,0 pH в случае испытания неионизированных веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: +/- 10%.

Наносимый объем пробы: от 10% до 20% от указанного объема при использовании пластинок с малым размером частиц (от 2 мкм до 10 мкм).

Жидкостная хроматография: изократическое элюирование

Состав подвижной фазы: содержание компонента-растворителя, присутствующего в меньшем количестве, может корректироваться в пределах +/- 30% (относительное содержание) или +/- 2% (абсолютное содержание), в зависимости от того, что из них больше (см. пример выше). Абсолютное содержание других компонентов не может быть изменено более чем на 10%.

pH водного компонента подвижной фазы: +/- 0,2 pH при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, или +/- 1,0 pH в случае испытания неионизированных веществ.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: +/- 10%.

Скорость подвижной фазы: +/- 50%; при изменении размеров колонки допускается большее корректирование (см. формулу ниже).

Характеристики колонки:

Неподвижная фаза:

- не допускается изменение заместителей неподвижной фазы (т.е. не допускается замена C18 на C8);

- размер частиц: допускается максимальное уменьшение размера на 50%, увеличение не допускается.

Размер колонки:

- длина: +/- 70%;

- внутренний диаметр: +/- 25%.

При изменении размера колонки скорость подвижной фазы может корректироваться, при необходимости, по формуле:

где: F1 - скорость подвижной фазы, указанная в частной фармакопейной статье, в миллилитрах в минуту;

F2 - скорректированная скорость подвижной фазы в миллилитрах в минуту;

l1 - длина колонки, указанная в частной фармакопейной статье, в миллиметрах;

l2 - длина используемой колонки, в миллиметрах;

d1 - внутренний диаметр колонки, указанный в частной фармакопейной статье, в миллиметрах;

d2 - внутренний диаметр используемой колонки в миллиметрах.

Температура: +/- 10 °C в случае контролируемой рабочей температуры при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Длина волны детектора: корректирование не допускается.

Объем вводимой пробы: может быть уменьшен при условии, что используемое детектирование и повторяемость пика(ов) остаются удовлетворительными; увеличение не допускается.

Жидкостная хроматография: градиентное элюирование

Регулирование условий хроматографирования при градиентном элюировании требует большей осторожности, чем при изократическом элюировании.

Состав подвижной фазы/градиентного элюирования: незначительное корректирование состава подвижной фазы и системы градиента допустимо при следующих условиях:

- выполняются требования пригодности хроматографической системы;

- основной(ые) пик(и) элюируется в пределах +/- 15% от указанного(ых) времени(ен) удерживания;

- элюирующая способность конечного состава подвижной фазы должна быть не ниже, чем у состава, указанного в частной фармакопейной статье.

Если соответствие требованиям пригодности хроматографической системы не может быть достигнуто, предпочтительным зачастую является оценка объема задержки или замена хроматографической колонки.

Объем задержки. Конфигурация используемого оборудования может значительно изменить разрешение, время удерживания или относительное удерживание, описанные в методике, что может произойти из-за избыточного объема задержки. В частных фармакопейных статьях обычно включают изократическую стадию до начала программы градиентного элюирования, обеспечивая адаптацию к временным точкам градиента с учетом разницы в объеме задержки между системой, использованной при разработке частной фармакопейной статьи, и фактически используемой системы. Адаптация продолжительности изократической стадии в зависимости от используемого аналитического оборудования входит в ответственность пользователя. Если в частной фармакопейной статье приведен объем задержки, установленный при ее разработке, то временные точки (t, мин), указанные в таблице градиента, могут быть заменены на адаптированные временные точки (tc, мин), рассчитанные по формуле:

где: D - объем задержки в миллилитрах;

D0 - объем задержки, использованный при разработке методики, в миллилитрах;

F - скорость подвижной фазы в миллилитрах в минуту.

Изократическая стадия, введенная с данной целью, может быть исключена при наличии данных по валидации методики, применяемой без указанной стадии.

pH водного компонента подвижной фазы: корректирование не допускается.

Концентрация солей в буферном компоненте подвижной фазы: корректирование не допускается.

Скорость подвижной фазы: корректирование допускается при изменении размеров колонки (см. формулу ниже).

Характеристики колонки:

Неподвижная фаза:

- не допускается изменение заместителей неподвижной фазы (т.е. не допускается замена C18 на C8;

- размер частиц: корректирование не допускается.

Размер колонки:

- длина: +/- 70%;

- внутренний диаметр: +/- 25%.

При изменении размера колонки скорость подвижной фазы может корректироваться, при необходимости, по формуле:

где: F1 - скорость подвижной фазы, указанная в частной фармакопейной статье, в миллилитрах в минуту;

F2 - скорректированная скорость подвижной фазы в миллилитрах в минуту;

l1 - длина колонки, указанная в частной фармакопейной статье в миллиметрах;

l2 - длина используемой колонки в миллиметрах;

d1 - внутренний диаметр колонки, указанный в частной фармакопейной статье в миллиметрах;

d2 - внутренний диаметр используемой колонки в миллиметрах.

Температура: +/- 5 °C в случае контролируемой рабочей температуры при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Длина волны детектора: корректирование не допускается.

Объем вводимой пробы: может быть уменьшен при условии, что используемое детектирование и повторяемость пика(ов) остаются удовлетворительными; увеличение не допускается.

Газовая хроматография

Характеристики колонки:

Неподвижная фаза:

- размер частиц: допускается максимальное уменьшение размера на 50 %, увеличение не допускается (набивные колонки);

- толщина слоя: от -50% до +100% (капиллярные колонки).

Размер колонки:

- длина: +/- 70%;

- внутренний диаметр: +/- 50%.

Скорость потока: +/- 50%.

Температура: +/- 10%.

Вводимый объем пробы: может быть изменен при условии, что используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными.

Сверхкритическая флюидная хроматография

Состав подвижной фазы: для набивных колонок содержание компонента-растворителя, присутствующего в меньшем количестве, может корректироваться в пределах +/- 30% (относительное содержание) или +/- 2% (абсолютное содержание) в зависимости от того, что из них больше. Для капиллярных колонок изменения не допускаются.

Длина волны детектора: корректирование не допускаются.

Характеристики колонки:

Неподвижная фаза:

- размер частиц: допускается максимальное уменьшение размера на 50%, увеличение не допускается (набивные колонки);

Размер колонки:

- длина: +/- 70%;

- внутренний диаметр:

+/- 25% (набивные колонки);

+/- 50% (капиллярные колонки).

Скорость потока: +/- 50%.

Температура: +/- 5 °C в случае контролируемой рабочей температуры.

Вводимый объем пробы: может быть уменьшен при условии, что используемое детектирование и повторяемость остаются удовлетворительными; увеличение не допускается.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

При количественном определении не учитывают пики растворителей и реактивов, а также пики подвижной фазы и матрицы испытуемого образца.

- Чувствительность детектора. Чувствительность детектора представляет собой сигнал на выходе на единицу концентрации или единицу массы вещества в подвижной фазе, входящей в детектор. Коэффициент относительной чувствительности детектора, называемый обычно коэффициентом чувствительности выражает чувствительность детектора к данному веществу относительно стандартного вещества. Поправочный коэффициент обратно пропорционален коэффициенту чувствительности.

- Метод внешнего стандарта. Концентрацию определяемого(ых) компонента(ов) находят путем сравнения сигнала(ов) детектора (пика(ов)), полученного(ых) для испытуемого раствора, и сигнала(ов) детектора (пика(ов)), полученного(ых) для раствора сравнения.

- Метод внутреннего стандарта. В испытуемый раствор и раствор сравнения вводят равные количества компонента (внутреннего стандарта), который разделяют с исследуемым веществом. Внутренний стандарт не должен взаимодействовать с исследуемым веществом, должен быть стабильным и не содержать примесей с временем удерживания, совпадающим с исследуемым веществом. Концентрацию исследуемого вещества определяют путем сравнения отношения площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту в испытуемом растворе, и отношения площадей или высот пиков, соответствующих исследуемому веществу и внутреннему стандарту в растворе сравнения.

- Метод внутренней нормализации. Содержание компонента исследуемого вещества в процентах рассчитывают путем определения площади соответствующего пика как части, выраженной в процентах от общей площади всех пиков, за исключением пиков растворителей или реактивов, или пиков, обусловленных компонентами подвижной фазы или матрицы испытуемого образца, а также пиков веществ, с площадью, равной или меньшей неучитываемого предела.

- Метод калибровочной функции. Определяют зависимость между измеренным или рассчитанным сигналом (y) и количеством (концентрацией, массой и т.д.) исследуемого вещества (x) и рассчитывают уравнение калибровочной функции. Результаты испытания определяют, исходя из измеренного или рассчитанного сигнала исследуемого вещества, с помощью обратной функции.

В испытаниях на родственные примеси как методом внешнего стандарта с использованием в качестве раствора сравнения разведенного испытуемого раствора, так и методом внутренней нормализации применяют поправочные коэффициенты, приведенные в частной фармакопейной статье (т.е. когда коэффициент чувствительности выходит за пределы от 0,8 до 1,2).

Если в испытании на родственные примеси определяют сумму примесей или проводят количественное определение примеси, важно выбрать соответствующие пороговые значения и подходящие условия для интегрирования площадей пиков. В таких испытаниях неучитываемый предел обычно составляет 0,05%. Интегрирование площади пика любой примеси, которая не полностью разделяется с основным пиком, преимущественно проводят экстраполяцией по нижним точкам пика (по касательной).

2.1.2.37. Капиллярный электрофорез

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Капиллярный электрофорез представляет собой физический метод анализа, основанный на миграции внутри капилляра заряженных частиц определяемых веществ, растворенных в растворе электролита, под влиянием постоянного электрического поля.

Скорость миграции частиц определяемого вещества под влиянием электрического поля с напряженностью E определяется их электрофоретической подвижностью и электроосмотической подвижностью буферного раствора внутри капилляра. Электрофоретическая подвижность растворенного вещества зависит от его свойств (электрический заряд, размер и форма молекул) и от свойств буферного раствора, в котором происходит процесс миграции (тип и ионная сила электролита, значение pH, вязкость и наличие добавок). Электрофоретическая скорость растворенного вещества , частицы которого принимаются за сферические, описывается уравнением:

где: q - эффективный заряд вещества;

r - Стоксовский радиус частиц вещества;

- вязкость раствора электролита;

V - приложенное напряжение;

L - общая длина капилляра.

При помещении капилляра, заполненного буферным раствором, в электрическое поле внутри капилляра начинается перемещение растворителя, называемое электроосмотическим потоком. Скорость электроосмотического потока зависит от электроосмотической подвижности , которая, в свою очередь, зависит от плотности заряда на внутренней стенке капилляра и свойств буферного раствора. Электроосмотическая скорость описывается уравнением:

где: - диэлектрическая постоянная буферного раствора;

- дзета-потенциал поверхности капилляра.

Скорость вещества определяется как:

В зависимости от заряда частиц вещества его электрофоретическая подвижность и электроосмотическая подвижность могут иметь одинаковое или противоположное направление. В условиях нормального капиллярного электрофореза анионы перемещаются в направлении, противоположном направлению электроосмотического потока, а их скорости меньше электроосмотической скорости. Катионы мигрируют в направлении, совпадающем с направлением электроосмотического потока, а их скорости превышают электроосмотическую скорость. В условиях, когда электроосмотическая скорость превышает электрофоретическую, катионы и анионы могут быть разделены в течение одного анализа.

Время (t), необходимое веществу для миграции на расстояние (l) от конца капилляра, в который вводится вещество, до точки детекции (эффективная длина капилляра), определяется уравнением:

В общем, при значении pH более 3 капилляры с немодифицированной поверхностью, изготовленные из плавленого кварца, имеют отрицательный заряд, обусловленный ионизацией силанольных групп, расположенных на внутренней стенке капилляра. Соответственно, электроосмотический поток направлен от анода к катоду. Для достижения надлежащей воспроизводимости скорости миграции растворенных веществ от анализа к анализу, электроосмотический поток должен оставаться постоянным. В некоторых случаях требуется уменьшить или устранить электроосмотический поток путем модификации внутренней стенки капилляра или изменения концентрации, состава и/или pH буферного раствора.

После введения испытуемого образца в капилляр каждый ион определяемого вещества, входящего в состав пробы, мигрирует в среде фонового электролита согласно своей электрофоретической подвижности как независимая зона. Дисперсия зоны, представляющая собой уширение полосы каждого вещества, является следствием различных явлений. В идеальных условиях вклад в процесс уширения зоны вещества вносит только молекулярная диффузия вещества вдоль капилляра (продольная диффузия). В таком идеальном случае эффективность зоны, выражаемая числом теоретических тарелок (N), определяется как:

где: D - коэффициент молекулярной диффузии вещества в буферном растворе.

На практике значительный вклад в дисперсию полосы вносят процессы тепловой конвекции, адсорбции образца на стенках капилляра, а также неодинаковая проводимость между образцом и буферным раствором, длина устройства для ввода пробы, размер ячейки детектора и расположение емкостей с буферными растворами на разных уровнях.

Разделение двух полос (выражаемое как разрешение, Rs) может быть достигнуто при изменении электрофоретической подвижности частиц определяемых веществ и электроосмотической подвижности, а также при увеличении эффективности полосы для каждого определяемого вещества, согласно уравнению:

где: и - электрофоретические подвижности двух разделяемых веществ;

- средняя электрофоретическая подвижность двух определяемых веществ .

ПРИБОР

Прибор для капиллярного электрофореза состоит из:

- регулируемого высоковольтного источника постоянного тока;

- двух резервуаров с буферными растворами, расположенных на одном и том же уровне и содержащих указанные анодный и катодный растворы;

- двух электродов (катода и анода), погруженных в резервуары с буферными растворами и соединенных с источником питания;

- капилляра, в котором проводится разделение (обычно изготовленного из плавленого кварца); при использовании некоторых типов детекторов капилляр имеет оптическое окошко, расположенное на уровне детектора; концы капилляра помещены в резервуары с буферными растворами; капилляр заполняют раствором, указанным в частной фармакопейной статье;

- подходящей системы ввода пробы;

- детектора, способного контролировать количество определяемых веществ, проходящих через разделяющий сегмент капилляра в течение определенного времени; детектирование обычно основано на абсорбционной спектрофотометрии (в ультрафиолетовой и видимой областях) или флуориметрии, в ряде случаев может быть использовано также кондуктометрическое, амперометрическое или масс-спектрометрическое детектирование; альтернативным способом детектирования веществ, которые не поглощают УФ-излучение и не флуоресцируют, является непрямое детектирование;

- термостата, способного поддерживать постоянную температуру внутри капилляра для получения воспроизводимых результатов разделения;

- регистрирующего устройства и походящего интегратора или компьютера.

Для точного количественного анализа критическими факторами являются определение процесса ввода пробы и его автоматизация. Ввод пробы может быть основан на использовании силы тяжести, давления, вакуума и электрокинетических сил. Количество каждого компонента образца, введенного электрокинетическим способом, зависит от его электрофоретической подвижности, что приводит к возможным неравным условиям для разных веществ при использовании данного режима ввода пробы.

Используют капилляр, буферные растворы, предварительную подготовку, раствор пробы и условия миграции, указанные в частной фармакопейной статье для испытуемого образца. Применяемый раствор электролита фильтруют для удаления твердых частиц и дегазируют для предотвращения образования пузырьков, мешающих работе детектора и созданию электрического контакта в капилляре во время процесса разделения. Для обеспечения воспроизводимых значений времени миграции веществ для каждой аналитической методики должна быть разработана методика тщательной промывки системы.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ЗОННЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ПРИНЦИП

В капиллярном зонном электрофорезе определяемые вещества разделяются в капилляре, содержащем только буферный раствор без какой-либо противоточной среды. В данном методе разделение обусловлено миграцией различных компонентов образца с различной скоростью в виде отдельных полос. Скорость перемещения каждой полосы зависит от электрофоретической подвижности частиц растворенного вещества и электроосмотического потока в капилляре (см. Общие принципы). Для улучшения разделения веществ, адсорбирующихся на кварцевой поверхности, могут быть использованы капилляры с модифицированной поверхностью.

При использовании данного вида капиллярного электрофореза возможно проведение анализа как малых (Mr < 2000), так и больших молекул (2000 < Mr < 100 000). Благодаря высокой эффективности капиллярного зонного электрофореза может быть проведено разделение молекул, имеющих очень незначительные различия в величинах отношений заряда к массе. При добавлении к разделяющему буферному раствору хиральных селекторов можно разделять хиральные соединения.

ОПТИМИЗАЦИЯ

Оптимизация разделения является комплексным процессом, в котором основную роль могут играть несколько параметров разделения. Основными факторами, которые следует принимать во внимание при разработке методик разделения, являются инструментальные параметры, а также параметры раствора электролита.

Инструментальные параметры

Напряжение. Для оптимизации прилагаемого напряжения и температуры капилляра полезен график Джоулева нагрева. Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению. Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, повышение температуры и, как результат, образование градиентов вязкости в буферном растворе, находящемся в капилляре. Данный эффект приводит к уширению полосы и уменьшению разрешения.

Полярность. Полярность электродов может быть нормальной (анод на входе и катод на выходе), электроосмотический поток при этом перемещается по направлению к катоду. В случае обращенной полярности электродов электроосмотический поток направлен от выхода из капилляра, и только заряженные определяемые вещества с электрофоретическими подвижностями, превышающими величину электрофоретического потока, попадают к выходу.

Температура. Температура влияет, главным образом, на вязкость и электрическую проводимость и, как следствие, на скорость миграции. В некоторых случаях увеличение температуры капилляра может вызвать конформационные изменения в молекулах белков, что изменяет их времена миграции и эффективность разделения.

Капилляр. Размеры капилляра (длина и внутренний диаметр) влияют на время анализа, эффективность разделения и загрузочную емкость. Увеличение как эффективной, так и общей длины капилляра может ослабить электрическое поле (в случае работы при постоянном напряжении), что приводит к увеличению времени миграции. Для определенного буферного раствора и электрического поля тепловая конвекция и, следовательно, уширение полос образца зависит от величины внутреннего диаметра капилляра. Кроме этого, величина внутреннего диаметра капилляра влияет на предел обнаружения, зависящий от объема введенной пробы и используемого детектора.

Поскольку адсорбция компонентов образца на стенке капилляра ограничивает эффективность, при разработке методики разделения следует предусмотреть способы предотвращения таких взаимодействий. В случае белков во избежание их адсорбции было разработано несколько способов. Некоторые из таких способов (использование экстремальных значений pH и адсорбция положительно заряженных буферных добавок) для предотвращения адсорбции белков требуют лишь изменения состава буферной смеси. В других способах внутренняя стенка капилляра покрывается полимером, ковалентно связанным с поверхностью, что предотвращает взаимодействие между белками и отрицательно заряженной поверхностью кварца. Для этих целей выпускаются готовые к использованию капилляры с покрытиями, состоящими из нейтральных гидрофильных, катионных или анионных полимеров.

Параметры раствора электролита

Тип и концентрация буферного раствора. Буферные растворы, подходящие для капиллярного электрофореза, имеют соответствующую буферную емкость в выбранном диапазоне pH и низкую подвижность для минимизации образования тока.

Подбор во всех возможных случаях буферного иона с подвижностью, соответствующей подвижности растворенного вещества, важен для минимизации искажения полосы. Тип растворителя, использованного для растворения определяемого вещества, также важен для достижения фокусирования вещества на колонке, что увеличивает эффективность разделения и улучшает детектирование.

Увеличение концентрации буферного раствора (для данного значения pH) уменьшает электроосмотический поток и скорость миграции растворенного вещества.

Значение pH буферного раствора. Значение pH буферного раствора может влиять на разделение вследствие изменения заряда определяемого вещества или добавок, а также электроосмотического потока. При разделении белков и пептидов изменение pH буферного раствора от значения, превышающего изоэлектрическую точку (pI), до значения, которое меньше ее, изменяет суммарный отрицательный заряд вещества на положительный. Увеличение pH буферного раствора обычно увеличивает электроосмотический поток.

Органические растворители. К водным буферным растворам для увеличения растворимости веществ или других добавок, и/или воздействия на степень ионизации компонентов образца могут быть добавлены органические модификаторы (метанол, ацетонитрил и др.). Добавление таких органических модификаторов к буферному раствору обычно вызывает уменьшение электроосмотического потока.

Добавки для хиральных разделений. Для разделения оптических изомеров к разделяющему буферному раствору добавляют хиральный селектор. Наиболее часто используемыми хиральными селекторами являются циклодекстрины, но кроме этого могут быть использованы краун-эфиры, полисахариды и белки. Поскольку хиральное распознавание управляется различными взаимодействиями между хиральным селектором и каждым из энантиомеров, разрешение, достигаемое для хиральных соединений, зависит, главным образом, от типа использованного хирального селектора. В связи с этим при разработке данных методик разделения может оказаться полезным испытание с циклодекстринами с различным размером полостей (, или ) или модифицированными циклодекстринами с нейтральными (метил-, этил-, гидроксиалкил- и другие) или способными к ионизации (аминометил-, карбоксиметил-, сульфобутиловые эфиры и другие) группами. При использовании модифицированных циклодекстринов следует принимать во внимание различия в степени замещения между разными партиями данных веществ, поскольку это может оказывать влияние на селективность. Другими факторами, контролирующими разрешение при хиральных разделениях, являются концентрация хирального селектора, состав и значение pH буферного раствора, а также температура. Достигнутую величину разрешения также может изменять использование органических добавок, таких как метанол или мочевина.

КАПИЛЛЯРНЫЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

ПРИНЦИП

В капиллярном гель-электрофорезе разделение происходит внутри капилляра, заполненного гелем, действующим как молекулярное сито. Поскольку молекулы меньшего размера легче проникают в структуру геля и мигрируют быстрее, чем большие, разделение молекул с близкими величинами отношения заряда к массе происходит в соответствии с их размерами. Таким образом, методом капиллярного гель-электрофореза по величинам молекулярных масс могут быть разделены различные биологические макромолекулы (например, белки и фрагменты ДНК), часто имеющие близкие величины отношения заряда к массе.

ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЕЛЕЙ

В капиллярном электрофорезе используют гели двух типов: химически модифицированные и динамически модифицированные. Химически модифицированные гели, например, поперечно-сшитый полиакриламид, получают полимеризацией мономеров внутри капилляра. Они обычно химически связаны с поверхностью плавленого кварца и не могут быть удалены без разрушения капилляра. Если гели используются для анализа белков, разделяющий буферный раствор обычно содержит натрия додецилсульфат и пробы перед вводом денатурируют нагреванием в смеси натрия додецилсульфата и 2-меркаптоэтанола или дитиотреитола. При использовании не восстанавливающих условий (например, анализ интактного антитела) 2-меркаптоэтанол и дитиотреитол не применяют. Разделение на поперечно-сшитых гелях может быть оптимизированно изменением разделяющего буферного раствора (в соответствии с указаниями в разделе, посвященном капиллярному зонному электрофорезу), и контролем пористости геля во время его получения. Пористость поперечно-сшитых полиакриламидных гелей может быть модифицирована путем изменения концентрации акриламида и/или пропорции сшивающего реагента. Как правило, уменьшение пористости геля приводит к уменьшению подвижности разделяемых веществ. Вследствие жесткости подобных гелей может быть использован только электрокинетический ввод пробы. Динамически модифицированные гели представляют собой гидрофильные полимеры, такие как линейный полиакриламид, производные целлюлозы, декстран и другие, способные растворяться в водных разделяющих буферных растворах и образующие разделяющую среду, которая также действует как молекулярное сито. Такие разделяющие среды получить легче, чем поперечно-сшитые полимеры. Они могут быть приготовлены в пробирке и помещены под давлением в капилляр с модифицированной поверхностью (без электроосмотического потока). Замена геля перед каждым вводом пробы обычно улучшает воспроизводимость разделения. Пористость гелей может быть увеличена при использовании полимеров с большей молекулярной массой (при определенной концентрации полимера) или путем уменьшения концентрации полимера (при определенной молекулярной массе полимера). Уменьшение пористости геля приводит к уменьшению подвижности вещества для того же самого буферного раствора. Поскольку при растворении таких полимеров в буферном растворе образуются растворы с низкой вязкостью, может быть использован как гидродинамический, так и электрокинетический ввод пробы.

КАПИЛЛЯРНОЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ

ПРИНЦИП

При изоэлектрическом фокусировании молекулы мигрируют под влиянием электрического поля до тех пор, пока они остаются заряженными в градиенте pH, создаваемом амфолитами, имеющими широкий диапазон значений pI (полиаминокарбоновые кислоты), растворенными в буферном растворе. Тремя основными стадиями изоэлектрического фокусирования являются загрузка, фокусирование и мобилизация.

Стадия загрузки. Могут быть использованы два способа:

- одноступенчатая загрузка: проба смешивается с амфолитами и вводится в капилляр под давлением или с помощью вакуума;

- последовательная загрузка: в капилляр вводят сначала ведущий буферный раствор, затем амфолиты, затем пробу, смешанную с амфолитами, после чего снова амфолиты и в конце замыкающий буферный раствор. Объем пробы должен быть небольшим, чтобы не повлиять на величину градиента pH.

Стадия фокусирования. При наложении напряжения амфолиты, в зависимости от своего суммарного заряда, мигрируют по направлению к катоду или аноду, тем самым создавая градиент от анода (более низкие значения pH) к катоду (более высокие значения pH). На данной стадии разделяемые компоненты мигрируют до тех пор, пока не достигнут значения pH, соответствующего своей изоэлектрической точке (pI) и ток не упадет до очень низких значений.

Стадия мобилизации. Если для детектирования необходима мобилизация, используют один из следующих способов:

- в первом способе мобилизация проводится в течение стадии фокусирования вследствие действия электроосмотического потока; электроосмотический поток должен быть достаточно малым, чтобы позволить провести фокусирование компонентов;

- во втором способе мобилизация проводится после стадии фокусирования путем использования положительного давления;

- в третьем способе мобилизация проводится после стадии фокусирования путем добавления солей в катодный или анодный резервуар (в зависимости от направления, выбранного для мобилизации) для изменения pH в капилляре при наложении напряжения. Поскольку pH изменяется, белки и электролиты перемещаются по направлению к резервуару, который содержит добавленные соли, и проходят через детектор.

Достигаемое разделение, выраженное как , зависит от градиента pH (dpH / dx), количества амфолитов, имеющих различные величины pI, коэффициента молекулярной диффузии (D), напряженности электрического поля (E) и изменения электрофоретической подвижности определяемого вещества при изменении pH :

ОПТИМИЗАЦИЯ

Основными параметрами, которые следует учитывать при разработке методик разделения, являются следующие.

Напряжение. В капиллярном изоэлектрическом фокусировании на стадии фокусирования используется электрическое поле с очень высокой напряженностью - от 300 В/см до 1000 В/см.

Капилляр. В зависимости от способа мобилизации (см. выше) электроосмотический поток должен быть уменьшен или подавлен. Капилляры с модифицированной поверхностью, как правило, уменьшают электроосмотический поток.

Растворы. Резервуар с анодным буферным раствором заполняют раствором, значение pH которого меньше значения pI большинства кислотных амфолитов, а катодный резервуар - раствором, значение pH которого больше значения pI большинства основных амфолитов. Для анодных буферных растворов часто используют фосфорную кислоту, а для катодных - натрия гидроксид.

Добавление полимера, такого как метилцеллюлоза, в раствор амфолита приводит к подавлению конвективных сил (если такие имеются) и электроосмотического потока, что обусловлено увеличением вязкости. Имеющиеся в продаже амфолиты покрывают множество диапазонов pH, а при необходимости для получения более широкого диапазона pH их можно смешивать. Широкие диапазоны pH используются для оценки величины изоэлектрической точки, в то время как более узкие применяются для улучшения точности анализа. Для калибровки можно использовать зависимость между временем миграции и изоэлектрической точкой для серии белковых маркеров. При необходимости, осаждение белков в изоэлектрической точке во время стадии фокусирования может быть предотвращено добавлением к буферному раствору глицерина, поверхностно-активных веществ, мочевины или цвиттер-ионных буферных растворов. Следует иметь в виду, что мочевина в зависимости от концентрации денатурирует белки.

МИЦЕЛЛЯРНАЯ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

ПРИНЦИП

В мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ, МЕКС) разделение происходит в растворе электролита, который содержит поверхностно-активное вещество в концентрации, превышающей критическую концентрацию мицеллообразования (ккм). Молекулы растворенного вещества распределяются между водным буферным раствором и псевдонеподвижной фазой, образованной мицеллами, в соответствии со своим коэффициентом распределения. Таким образом, данный метод можно рассматривать как гибрид электрофореза и хроматографии. Он может быть использован для разделения как заряженных, так и нейтральных растворенных веществ, сохраняя при этом эффективность, скорость, а также оборудование, присущие капиллярному электрофорезу. Одним из поверхностно-активных веществ, широко используемым в МЭКХ, является анионное поверхностно-активное вещество натрия додецилсульфат. Применяются также и другие поверхностно-активные вещества, например, катионные поверхностно-активные вещества, такие как соли цетилтриметиламмония.

Механизм разделения заключается в следующем. В нейтральной или щелочной среде возникает сильный электроосмотический поток, который перемещает ионы разделяющего буферного раствора по направлению к катоду. Если в качестве поверхностно-активного вещества используется натрия додецилсульфат, электрофоретическая миграция анионных мицелл происходит в противоположном направлении, т.е. к аноду. В результате общая скорость миграции мицелл уменьшается по сравнению со скоростью потока раствора электролита. В случае нейтральных разделяемых веществ скорость миграции определяемого вещества будет зависеть только от величины его коэффициента распределения между мицеллой и водным буферным раствором, поскольку определяемое вещество способно распределяться между мицеллой и водным буферным раствором не обладает электрофоретической подвижностью. На электрофореграмме пики, соответствующие каждому из разделяемых незаряженных растворенных веществ, всегда находятся между пиком маркера электроосмотического потока и пиком мицеллы (время между этими двумя пиками называется окном разделения). Для заряженных растворенных веществ скорость миграции зависит как от коэффициента распределения вещества между мицеллой и водным буферным раствором, так и от электрофоретической подвижности вещества в отсутствии мицеллы.

Поскольку механизм разделения в МЭКХ нейтральных и слабоионизированных растворенных веществ главным образом хроматографический, миграция растворенного вещества и разрешение могут быть охарактеризованы с помощью коэффициента удерживания вещества , также известного как концентрационный коэффициент распределения (Dm), который представляет собой отношение количества моль растворенного вещества, находящегося в мицелле, к количеству моль данного вещества в подвижной фазе.

Для нейтральных соединений определяется как:

где: tR - время миграции растворенного вещества;

t0 - время анализа неудерживаемого растворенного вещества (определяемое с помощью маркера электроосмотического тока, не входящего в мицеллу, например, метанола);

tmc - время миграции мицеллы (измеряется с помощью маркера мицеллы, такого как Судан III, который мигрирует, полностью находясь в мицеллах);

K - коэффициент распределения растворенного вещества;

VS - объем мицеллярной фазы;

VM - объем подвижной фазы.

Аналогично, разрешение между пиками двух близко мигрирующих веществ (Rs) определяется как:

где: N - число теоретических тарелок для одного из веществ;

- селективность;

и - коэффициенты удерживания для обоих веществ соответственно .

Подобные, но не идентичные уравнения для значений и Rs используются и в случае разделения заряженных веществ.

ОПТИМИЗАЦИЯ

Основными параметрами, которые следует принимать во внимание при разработке методик разделения в МЭКХ, являются инструментальные, а также параметры раствора электролита.

Инструментальные параметры

Напряжение. Время разделения обратно пропорционально приложенному напряжению. Однако увеличение напряжения может вызвать избыточное выделение тепла, повышение температуры и, как результат, образование градиентов температуры и вязкости в буферном растворе, находящемся в капилляре. Данный эффект особенно характерен для буферных растворов с высокой электрической проводимостью и содержащих мицеллы. Неудовлетворительная тепловая конвекция приводит к уширению полосы и уменьшает разрешение.

Температура. Изменения температуры капилляра влияют на коэффициент распределения вещества между буферным раствором и мицеллой, критическую концентрацию мицеллообразования и вязкость буферного раствора. Данные параметры вносят вклад в величину времени миграции растворенного вещества. Использование надлежащей охлаждающей системы улучшает воспроизводимость времени миграции растворенных веществ.

Капилляр. Как и в случае капиллярного зонного электрофореза, размеры капилляра (длина и внутренний диаметр) влияют на продолжительность анализа и эффективность разделения. Увеличение как эффективной, так и общей длины капилляра может ослабить электрическое поле (в случае работы при постоянном напряжении), увеличить время миграции и улучшить эффективность разделения. Внутренний диаметр контролирует тепловую конвекцию (для определенного буферного раствора и электрического поля) и, соответственно, уширение полосы вещества.

Параметры раствора электролита

Тип и концентрация поверхностно-активного вещества. Тип поверхностно-активного вещества таким же образом, как и неподвижная фаза в хроматографии, влияет на разрешение, поскольку изменяет селективность разделения. Величина нейтрального соединения линейно увеличивается при увеличении концентрации поверхностно-активного вещества в подвижной фазе. Поскольку разрешение в МЭКХ достигает максимума при приближении величины к значению , изменение концентрации поверхностно-активного вещества в подвижной фазе изменяет величину разрешения.

Значение pH буферного раствора. Несмотря на то, что значение pH не изменяет коэффициент распределения неионизированных веществ, оно может изменять электроосмотический поток в капиллярах с немодифицированной поверхностью. Уменьшение значения pH буферного раствора уменьшает электроосмотический потоки и тем самым увеличивает разрешение нейтральных веществ в МЭКХ вследствие увеличения продолжительности анализа.

Органические растворители. Для улучшения МЭКХ-разделения гидрофобных соединений к раствору электролита могут быть добавлены органические модификаторы (метанол, пропанол, ацетонитрил и др.). Добавление таких модификаторов обычно уменьшает время миграции и селективность разделения. Поскольку добавление органических модификаторов влияет на величину критической концентрации мицеллообразования, определенная концентрация поверхностно-активного вещества может быть использована только в пределах некоторого процентного содержания органического модификатора до прекращения мицеллообразования или отрицательного влияния на этот процесс, приводящего к исчезновению мицелл и прекращению разделения. Диссоциация мицелл в присутствии большого количества органического растворителя не всегда означает невозможность дальнейшего разделения; в некоторых случаях гидрофобное взаимодействие между мономером ионного поверхностно-активного вещества и нейтральным разделяемым веществом приводит к образованию сольвофобных комплексов, которые могут быть разделены электрофоретически.

Добавки для хиральных разделений. Для разделения энантиомеров с использованием МЭКХ хиральный селектор включается в мицеллярную систему, либо ковалентно связывается с поверхностно-активным веществом либо добавляется к раствору электролита, в котором происходит разделение мицелл. Мицеллы, способные к хиральным разделениям, обычно включают в себя соли N-додеканоил-L-аминокислот, соли желчных кислот и т.д. Хиральное разделение может быть также проведено с помощью циклодекстринов, добавленных к растворам электролитов, содержащих мицеллы ахиральных поверхностно-активных веществ.

Другие добавки. Существует ряд подходов, предполагающих добавление различных реагентов к буферному раствору для изменения селективности. Добавление некоторых типов циклодекстринов к буферному раствору также может быть использовано для уменьшения взаимодействия гидрофобных веществ с мицеллой, тем самым увеличивая селективность разделения для такого типа соединений.

Добавление веществ, которые способны изменять взаимодействие между разделяемым веществом и мицеллой вследствие адсорбции на последней, используется для улучшения селективности разделения в МЭКХ. Данные добавки могут представлять собой второе поверхностно-активное вещество (ионное или неионное), которое увеличивает количество смешанных мицелл или катионов металлов, которые растворяются в мицелле и образуют координационные комплексы с разделяемыми веществами.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Площади пиков должны быть разделены соответствующими временами миграции, чтобы в итоге получить исправленную площадь, позволяющую компенсировать:

- смещение времен удерживания от анализа к анализу и тем самым уменьшить различия в величине аналитического сигнала;

- различные аналитические сигналы компонентов пробы с различными временами миграции.

При использовании внутреннего стандарта следует убедиться в том, что пик испытуемого вещества не перекрывается пиком внутреннего стандарта.

РАСЧЕТЫ

По полученным данным рассчитывают содержание испытуемого компонента или компонентов. Если указано, рассчитывают процентное содержание одного или нескольких компонентов образца путем определения исправленной площади пика или пиков как процентной части исправленных площадей всех пиков, исключая пики, соответствующие растворителям или любым добавленным реагентам (метод нормализации). Рекомендуется использование автоматической системы интегрирования (интегратора или системы получения и обработки данных).

ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ

Параметры пригодности системы используются для проверки поведения системы капиллярного электрофореза. Выбор параметров зависит от используемого вида капиллярного электрофореза. К ним относятся: коэффициент емкости (только для мицеллярной электрокинетической хроматографии), число теоретических тарелок (N), коэффициент симметрии (AS) и разрешение (RS). В предыдущих разделах были описаны уравнения для расчетов N и RS, ниже приведены уравнения, позволяющие рассчитать эти параметры из электрофореграмм.

ЧИСЛО ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ТАРЕЛОК

Число теоретических тарелок (N) может быть рассчитано по формуле:

где: tR - время миграции или расстояние по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляра, опущенного из максимума пика, соответствующего компоненту;

wh - ширина пика на половине высоты.

РАЗРЕШЕНИЕ

Разрешение (RS) близких по высоте пиков двух компонентов может быть рассчитано по формуле:

где: tR1 и tR2 - времена миграции или расстояния по базовой линии от точки ввода пробы до перпендикуляров, опущенных из максимумов двух соседних пиков;

wh1 и wh2 - ширины пиков на половине высоты.

При необходимости разрешение может быть рассчитано путем измерения высоты впадины (Hv) между двумя частично разделенными пиками в стандартном образце, высоты меньшего пика (Hp) и расчета отношения пик/впадина:

КОЭФФИЦИЕНТ СИММЕТРИИ

Коэффициент симметрии пика (As) рассчитывают по формуле:

где: w0,05 - ширина пика на одной двадцатой его высоты;

d - расстояние между перпендикуляром, опущенным из максимума пика, и передней границей пика на одной двадцатой его высоты.

Испытания на повторяемость площадей (стандартное отклонение площадей или отношений площадь/время миграции) и времен миграции (стандартное отклонение времени миграции) используются в качестве параметров пригодности. Повторяемость времени миграции обеспечивает испытание пригодности процедуры промывки капилляра. Альтернативным способом предупреждения ухудшения повторяемости времени миграции является использование времени миграции относительно времени миграция внутреннего стандарта.

Для определения родственных примесей может быть полезно испытание на подтверждение отношения сигнал/шум для стандартного образца (или определение предела количественного определения).

ОТНОШЕНИЕ СИГНАЛ/ШУМ

Пределы обнаружения и количественного определения отвечают отношению сигнал/шум 3 и 10 соответственно. Отношение сигнал/шум (S/N) рассчитывают по формуле:

где: H - высота пика рассматриваемого компонента на электрофореграмме, указанного раствора сравнения; высоту измеряют от максимума пика до экстраполированной базовой линии сигнала, наблюдаемого на расстоянии, равном не менее двадцатикратной ширине пика на половине его высоты;

h - область фонового шума на электрофореграмме, полученной при введении контрольного раствора, наблюдаемая на расстоянии, равном не менее двадцатикратной ширины пика на половине высоты пика на электрофореграмме указанного раствора сравнения и, по возможности, расположенная по обе стороны от места возможного обнаружения пика.

2.1.2.38. Изоэлектрическое фокусирование

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ) представляет собой метод электрофореза, основанный на разделении белков в соответствии с их изоэлектрическими точками. Разделение проводится на пластине из полиакриламидного или агарозного геля, содержащего смесь амфотерных электролитов (амфолитов). При действии электрического поля амфолиты мигрируют в геле, создавая градиент pH. В некоторых случаях используют гели с фиксированным градиентом pH, полученные путем включения слабых кислот или оснований в определенные места геля во время его приготовления. Когда нанесенные белки достигают фракции геля, которая имеет такое же значение pH, что и их изоэлектрическая точка (pI), заряд данных белков нейтрализуется и миграция прекращается. Градиенты могут быть созданы в различных диапазонах pH в зависимости от выбранной смеси амфолитов.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

В изоэлектрической точке молекула белка не заряжена и не может передвигаться в матрице геля под действием электрического поля. Ее перемещение, однако, может происходить в результате диффузии. Градиент pH вынуждает белок оставаться в изоэлектрическом состоянии, концентрируя данное вещество. Такое концентрирование называется "фокусированием". Увеличение приложенного напряжения или уменьшение количества нанесенного вещества улучшает разделение полос. Величина приложенного напряжения ограничена выделяющейся теплотой, которая должна быть рассеяна. Использование тонких слоев геля, а также пластин с эффективным охлаждением, контролируемых термостатирующим устройством, предотвращает возгорание геля и в тоже время обеспечивает точное фокусирование. Разделение оценивают по минимальной разности pI , которая необходима для разделения двух соседних полос:

где: D - коэффициент диффузии белка;

- градиент pH;

E - напряженность электрического поля, в вольтах на сантиметр;

- изменение подвижности вещества при изменении pH в диапазоне, близком к pI.

Поскольку D и для определенного белка не могут быть изменены, улучшить разделение можно при использовании более узкого диапазона pH либо при увеличении напряженности электрического поля.

Разрешение между полосами белков в случае использования ИЭФ-геля, содержащего ведущие амфолиты, достаточно хорошее. Улучшить разрешение можно при использовании фиксированных градиентов pH, для создания которых применяются буферные вещества, аналогичные ведущим электролитам, сополимеризованные с матрицей геля. При использовании геля, содержащего ведущие электролиты, могут быть разделены белки, значения pI которых отличаются в пределах 0,02 единиц pH, в то время как фиксированные градиенты pH позволяют разделить белки, изоэлектрические точки которых различаются приблизительно на 0,001 pH.

ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ

Следует уделять особое внимание характеристикам и/или подготовке образца. Наличие солей в образце может вызвать ряд проблем, поэтому лучше всего при его приготовлении использовать деионизированную воду или 2% раствор амфолитов, используя при необходимости диализ или гель-фильтрацию.

Время, необходимое для завершения фокусирования в тонком слое полиакриламидных гелей, определяют путем нанесения окрашенного белка (например, гемоглобина) в различные области поверхности геля и применения электрического поля: стабильное состояние достигается тогда, когда все нанесения дают идентичный образец полос. В ряде случаев о завершении фокусирования судят по времени, прошедшему после нанесения образца.

ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на подлинность. В этом случае испытуемый образец, мигрирующий на геле, сравнивается с подходящим стандартным образцом и ИЭФ-калибровочными белками. ИЭФ может быть использовано в качестве испытания на предельное содержание. При этом плотность полосы на ИЭФ сравнивается, соответственно, с полосой на ИЭФ, появляющейся при использовании стандартного образца, если измерение производится с помощью денситометра или аналогичного устройства, позволяющего определить относительную концентрацию белка в полосе. ИЭФ может быть также использовано при испытании на количественное содержание белков.

ПРИБОР

Прибор для ИЭФ состоит из:

- управляемого генератора для создания постоянного потенциала, тока и мощности; используются потенциалы величиной 2500 В: они считаются оптимальными для используемых условий работы; рекомендуется источник тока, имеющий постоянную мощность до 30 Вт;

- жесткой пластиковой ИЭФ камеры, в которой находится охлаждаемая пластинка или подходящий материал, служащий основой для нанесения геля;

- полимерной крышки с платиновыми электродами, которые соединены с гелем с помощью бумажных фитилей подходящей ширины, длины и толщины, пропитанных растворами анодных и катодных электролитов.

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ В ПОЛИАКРИЛАМИДНЫХ ГЕЛЯХ: ПОДРОБНАЯ МЕТОДИКА

Приведенная ниже методика представляет собой подробное описание процедуры ИЭФ в пластинах полиакриламидного геля, используемой при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЕЙ

Матрица формования. Матрица формования (см. рисунок 2.1.2.38.-1) состоит из стеклянной пластинки (A), на которую для облегчения работы с гелем помещена полиэфирная пленка (B), одной или нескольких распорных деталей (C), второй стеклянной пластинки (D) и зажимов, скрепляющих всю конструкцию.

Рисунок 2.1.2.38.-1. - Матрица формования

7,5%-ный полиакриламидный гель. 29,1 г акриламида P и 0,9 г метиленбисакриламида P растворяют в 100 мл воды P. К 2,5 объемам полученного раствора прибавляют смесь амфолитов, указанных в частной фармакопейной статье, и доводят водой P до объема 10 мл. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют.

Приготовление формы. Полиэфирную пленку помещают на нижнюю стеклянную пластинку, вставляют распорную деталь, помещают вторую стеклянную пластинку и скрепляют конструкцию зажимами. Перед использованием раствор помещают на магнитную мешалку и прибавляют к нему 0,25 объема раствора 100 г/л аммония персульфата P и 0,25 объема тетраметилэтилендиамина P. Немедленно заполняют раствором пространство между стеклянными пластинками формы.

МЕТОДИКА

Форму разбирают на составные части и, используя полиэфирную пленку, переносят гель на охлажденную подложку, увлажненную несколькими миллилитрами подходящей жидкости, избегая образования воздушных пузырьков. Готовят испытуемые растворы и растворы сравнения, в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье. Для нанесения образца на поверхность геля помещают полоски бумаги размером приблизительно 10 мм x 5 мм и пропитывают каждую из них указанным количеством испытуемого раствора и раствора сравнения. Также наносят указанное в частной фармакопейной статье количество раствора белков с известными величинами изоэлектрических точек, служащих в качестве маркеров pH для калибровки геля. В некоторых протоколах вместо импрегнированных бумажных полосок используют гель, который имеет лунки, предназначенные для помещения раствора образца. Отрезают 2 полоски бумаги длиной, соответствующей длине геля, и пропитывают их растворами электролитов: кислотой для анода и щелочью для катода (составы анодного и катодного растворов приводятся в частной фармакопейной статье). Эти бумажные фитильки помещают на каждую сторону геля на расстоянии нескольких миллиметров от его границы. Устанавливают крышку так, чтобы электроды контактировали с полосками бумаги (соответственно, анодным и катодным полями). Выполняют изоэлектрическое фокусирование, используя параметры, электрического поля, указанные в частной фармакопейной статье. Когда миграция смеси стандартных белков стабилизируется, отключают источник питания. С помощью пинцета удаляют полоски, предназначенные для нанесения образца, и 2 электродных фитилька. Погружают гель в фиксирующий раствор для изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле P. Выдерживают, осторожно встряхивая, при комнатной температуре в течение 30 мин. Сливают раствор и прибавляют 200 мл обесцвечивающего раствора P. Выдерживают при перемешивании в течение 1 ч. Высушивают гель, прибавляют Кумасси красящий раствор P. Выдерживают в течение 30 мин и обесцвечивают гель путем пассивной диффузии обесцвечивающего раствора P до тех пор, пока на чистом фоне не будут хорошо видны полосы. Положение и интенсивность полос на электрофореграмме, отмечают в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье.

ИЗМЕНЕНИЯ ПОДРОБНОЙ МЕТОДИКИ (ПРЕДМЕТ ВАЛИДАЦИИ)

Там, где делается ссылка на общую методику изоэлектрического фокусирования, изменения в методологии или методике изоэлектрического фокусирования могут быть предметом валидации. Они включают в себя:

- использование имеющихся в продаже гелей заводского производства, а также окрашивающих и обесцвечивающих наборов;

- использование фиксированных градиентов pH;

- использование стержневых гелей;

- использование кассет геля различных размеров, включая ультратонкие (0,2 мм) гели;

- изменения в методике нанесения образца, включающие различные объемы образца или использование шаблонов или фитильков, изготовленных не из бумаги;

- использование альтернативных условий перемещения, включающих изменения электрического поля в зависимости от размеров геля и оборудования, а также использование фиксированных времен миграции вместо субъективной интерпретации стабильности полосы;

- включение стадии предварительного фокусирования;

- использование автоматизированного оборудования;

- использование гелей агарозы.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ

При использовании альтернативных методик по отношению к описанной методике, они должны быть валидированы. Для валидации разделения могут быть использованы следующие критерии:

- образование устойчивого градиента pH с желаемыми характеристиками, оцениваемого, например, с помощью окрашенных маркеров pH с известными величинами изоэлектрических точек;

- сравнение электрофореграммы, прилагаемой к стандартному образцу, с электрофореграммой, полученной при проведении испытания;

- любые другие критерии валидации, указанные в частной фармакопейной статье.

СПЕЦИФИЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ МЕТОДИКИ

Изменения общей методики, необходимые при анализе конкретных субстанций, могут быть подробно описаны в частных фармакопейных статьях. Они включают:

- добавление в гель мочевины (обычно 3 M концентрация достаточна для поддерживания белка в растворенном состоянии, но может быть использована концентрация до 8 M): некоторые белки в изоэлектрической точке выпадают в осадок, в этом случае для того, чтобы белок оставался в растворе, в гель вводится мочевина; при использовании мочевины следует применять только ее свежие растворы, чтобы не допустить карбамоилирования белка;

- использование альтернативных способов окрашивания;

- использование добавок для геля, таких как неионные детергенты (например, октилглюкозид) или цвиттер-ионные детергенты (например, CHAPS или CHAPSO), и добавление амфолита к образцу для предотвращения процессов агрегации и преципитации белков.

ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ СЛЕДУЕТ ПРИНИМАТЬ ВО ВНИМАНИЕ

Образцы могут наноситься на любой участок поверхности геля, но для того, чтобы защитить белки от экстремальных значений pH, образцы не должны наноситься в непосредственной близости от электродов. При разработке методики аналитик может нанести белок на гель в трех местах (посередине и на обоих концах). Образцы белка, наносимые на противоположные концы геля, могут быть различными.

При слишком продолжительном фокусировании в геле может возникнуть процесс, называемый катодным дрейфом, при котором градиент pH с течением времени разрушается. Причины данного явления не совсем ясны, но факторами, вызывающими катодный дрейф, могут быть электроэндоосмос и абсорбция углерода диоксида. Для исследования этой проблемы могут быть использованы фиксированные градиенты pH.

Во время проведения фокусирования важно обеспечить эффективное охлаждение (приблизительно 4 °C) подложки, на которую помещен гель. Высокие напряженности электрического поля, используемые во время изоэлектрического фокусирования, могут приводить к перегреванию и влиять на качество фокусируемого геля.

2.1.2.39. Пептидное картирование

Пептидное картирование представляет собой метод идентификации белков, особенно получаемых методом рекомбинантных ДНК. Метод включает химическое или ферментативное расщепление белков до образования пептидных фрагментов с последующим их разделением и идентификацией воспроизводимым способом. Это надежный метод испытания, позволяющий идентифицировать замену практически любой отдельной аминокислоты, произошедшей вследствие ошибок при транскрипции комплементарной ДНК (кДНК), или точечных мутаций. Пептидное картирование представляет собой процедуру сравнения, поскольку сравнение полученной информации с обработанным таким же образом стандартным образцом позволяет подтвердить первичную структуру белка, определить возможные изменения первичной структуры в случае наличия таковых, подтвердить соответствие процесса и генетическую стабильность. Каждый белок обладает уникальными характеристиками, которые должны быть хорошо изучены, чтобы научные и аналитические подходы позволяли валидировать разработку пептидной карты, обеспечивающей достаточную специфичность.

Данный раздел содержит детальное описание аспектов использования и валидации метода пептидного картирования с целью получения характеристики анализируемого белка, оценки стабильности клеточных систем экспрессии, используемых для получения продуктов рекомбинантных ДНК и оценки согласованности процесса в целом - в отношении как оценки стабильности продукта, так и обеспечения идентичности белка, либо определения содержания протеинов с изменениями в структуре.

Пептидное картирование не является общим методом, а заключается в составлении индивидуальных карт для каждого отдельного белка. Хотя технологии продолжают стремительно развиваться, существует ряд методов, которые являются общепризнанными. При наличии определенных расхождений с данными методами они будут описываться в соответствующих частных фармакопейных статьях.

Составление пептидных карт может рассматриваться как метод получения "отпечатков пальцев" белка и представляет собой получаемую в результате ряда химических процессов полную расшифровку анализируемого белка. Метод включает четыре принципиальные стадии: выделение и очистка белка - в случае, если белок входит в состав какой-либо смеси; избирательное расщепление пептидных связей; хроматографическое разделение образующихся пептидных фрагментов; анализ и идентификация пептидов. Анализируемый образец подвергается расщеплению и анализу параллельно со стандартным образцом. Полное расщепление пептидных связей более вероятно, когда вместо химических гидролизующих реагентов используются такие ферменты, как эндопептидазы (например, трипсин). Для того, чтобы карта была информативной, она должна содержать достаточное количество пептидов. С другой стороны, в случае, если пептидных фрагментов будет слишком много, карта может утратить свою специфичность, поскольку у многих белков может оказаться аналогичный профиль.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА

Выделение и очистка необходимы при анализе нерасфасованных лекарственных средств или лекарственных препаратов, содержащих вспомогательные вещества мешающие анализу или носители белков о чем, при необходимости, будут указывать в частной фармакопейной статье. Количественное извлечение белка из лекарственного препарата должно быть валидировано.

ИЗБИРАТЕЛЬНОЕ РАСЩЕПЛЕНИЕ ПЕПТИДНЫХ СВЯЗЕЙ

Выбор подхода, используемого для расщепления пептидных связей будет зависеть от анализируемого белка. Процедура выбора включает определение типа расщепления (химического или ферментативного), а также типа протеолитического реагента в рамках выбранной категории. В таблице 2.1.2.39.-1 приведен ряд протеолитических реагентов и параметры их специфичности. Данный список не является исчерпывающим и будет дополняться по мере определения других реагентов, способных расщеплять пептидные связи.

Таблица 2.1.2.39.-1. - Примеры реагентов для расщепления пептидных связей

Предварительная обработка образца. В зависимости от размера или конфигурации белка используют различные подходы к предварительной обработке образца. Если для расщепления пептидных связей белка с молекулярной массой более 100 000 Да используют трипсин, остатки лизина должны быть защищены путем получения производных с цитраконовым или малеиновым ангидридами, так как в противном случае может образоваться слишком много пептидных фрагментов.

Предварительная обработка расщепляющего агента. Предварительная обработка расщепляющего агента, особенно ферментов, может быть необходима для обеспечения требуемой чистоты и воспроизводимости карты. Например, трипсин, используемый в качестве реагента для расщепления пептидных связей, следует обработать тозил-L-фенилаланинхлор-метилкетоном с целью инактивации химотрипсина. Другие методы, например, очистка трипсинаметодом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или иммобилизация фермента на гелевом носителе, успешно используются, особенно при ограниченном количестве имеющегося белка.

Предварительная обработка белка. При определенных условиях может потребоваться концентрирование образца или отделение белка от используемых в готовом продукте вспомогательных веществ и стабилизаторов, если они мешают процедуре картирования. Используемые для предварительной подготовки белка физические процедуры могут включать ультрафильтрацию, колоночную хроматографию и лиофилизацию. С целью проведения денатурации белка до процедуры пептидного картирования возможно использование других методов подготовки, таких как добавление хаотропных агентов (например, мочевины). Для обеспечения полного доступа фермента к местам разрыва связей и частичной денатурации белка часто до проведения про теолитического расщепления необходимо восстановление и алкилирование дисульфидных связей. Расщепление пептидных связей с использованием трипсина может сопровождаться появлением в пептидной карте ряда неточностей ввиду протекающих параллельно с реакцией протеолитического расщепления побочных реакций, таких как неспецифическое расщепление, дезаминирование, дисульфидная изомеризация, окисление остатков метионина, образование пироглутаминовых групп при дезаминировании глутамина на N-концевой стороне пептида. Более того, при автогидролизе трипсина также могут появляться дополнительные пики. Интенсивность их образования зависит от соотношения содержания трипсина к белку. Для предотвращения автогидролиза растворы протеаз могут быть приготовлены при pH, отличном от оптимального значения (например, при pH 5 для трипсина), благодаря чему фермент не перейдет в активное состояние до момента разведения с буферным раствором при проведении расщепления.

Установление оптимальных условий для расщепления пептидных связей. Факторы, которые влияют на полноту и эффективность расщепления протеинов, являются факторами, оказывающими влияние на химические и ферментативные реакции.

pH реакционной среды. Значение pH смеси, в которой осуществляется расщепление пептида, определяется эмпирически что обеспечивает оптимизацию состояния расщепляющего реагента. Например, при использовании бромциана в качестве расщепляющего реагента необходимым является создание сильнокислой среды (например, pH 2, муравьиная кислота); однако при использовании трипсина в качестве расщепляющего агента оптимальной является слабощелочная среда (pH 8). В целом значение pH реакционной среды не должно изменять химическую структуру белка в ходе реакции расщепления и не должно изменяться в ходе проведения реакции фрагментации.

Температура. Для большинства реакций расщепления наиболее подходящей является температура в интервале от 25 °C до 37 °C. Создаваемая температура должна способствовать минимизации побочных химических реакций. Тип испытуемого белка определяет выбор температуры реакционной среды, поскольку некоторые белки с повышением температуры склонны к денатурации. Например, расщепление рекомбинантного бычьего соматропина проводится при температуре 4 °C, поскольку при более высокой температуре он осаждается в ходе проведения реакции расщепления.

Время. В случае если имеется достаточное количество испытуемого образца, следует провести испытание по определению времени, являющегося оптимальным для получения воспроизводимой карты и достаточным для проведения полного расщепления. Продолжительность расщепления варьируется от 2 ч до 30 ч. Реакция прекращается либо прибавлением кислоты, которая не оказывает влияния на полученную пептидную карту, либо замораживанием.

Количество используемого расщепляющего реагента. Для обеспечения достаточного быстрого расщепления (от 6 ч до 20 ч) используется избыточное количество расщепляющего реагента; тем не менее, его количество должно быть минимизировано, чтобы предотвратить вклад реагента в структуру пептидной карты. Обычно анализируемый протеин и реагент берут в соотношении 20:1 или 200:1. Для оптимизации процедуры расщепления рекомендуется добавлять расщепляющий агент в два или более этапов. При этом конечный объем реагирующей смеси должен оставаться достаточно небольшим для обеспечения следующего этапа пептидного картирования - разделения. Для того, чтобы исключить возможное влияние искажающих продуктов расщепления (артефактов) на результаты последующего анализа, проводится контрольное определение со всеми реагентами за исключением анализируемого белка.

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ

Для картирования используют различные методы разделения белков. Выбор метода зависит от белка, для которого составляется пептидная карта. В таблице 2.1.2.39.-2 перечислены методы, успешно используемые для разделения пептидов. В данном разделе приведено описание метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), одного из наиболее часто используемых методов хроматографического разделения.

Таблица 2.1.2.39.-2. - Методы, используемые для разделения пептидных фрагментов

Критическими факторами при ВЭЖХ разделении являются чистота растворителей и подвижной фазы. Для проведения обращенно-фазовой ВЭЖХ рекомендуется использование растворителей и воды степени чистоты "для ВЭЖХ". Растворенные газы являются проблемой для градиентных систем в тех случаях, когда растворимость газа в растворителе может быть меньше в смеси, чем в самом растворителе. В качестве эффективного способа дегазации может быть использована вакуумная дегазация и воздействие ультразвуком. В случае если твердые частицы в растворителе попадут в хроматографическую систему, они могут нарушить герметичность клапанов насоса или засорить верхнюю часть хроматографической колонки. В связи с этим рекомендуется проведение фильтрации до и после насоса.

Хроматографическая колонка. Для каждого белка выбор колонки осуществляется эмпирически. Колонки с размером пор от 10 нм до 30 нм, заполненные сорбентом на основе силикагеля, могут обеспечить оптимальное разделение. Для небольших пептидов неподвижные фазы силикагель октилсилильный для хроматографии P (3 - 10 мкм) и силикагель октадецилсилильный для хроматографии P (3 - 10 мкм) в качестве наполнителей колонки являются более эффективными, чем силикагель бутилсилильный для хроматографии P (5 - 10 мкм).

Растворитель. Наиболее часто используемым растворителем является вода с ацетонитрилом в качестве органического модификатора с добавлением не более 0,1% трифторуксусной кислоты. При необходимости, для солюбилизации компонентов гидролизата, добавляют пропанол или 2-пропанол, при условии, что их добавление не приведет к чрезмерному повышению вязкости компонентов.

Подвижная фаза. Подвижная фаза, содержащая фосфатный буфер, используется для обеспечения возможности выбора pH, поскольку изменение pH в интервале от 3,0 до 5,0 улучшает разделение пептидов, содержащих кислотные остатки (например, глутаминовая и аспарагиновая кислоты). Натрия или калия фосфаты, ацетат аммония, фосфорная кислота при значении pH между 2 и 7 (или выше при использовании полимерного наполнителя) используются с ацетонитрильным градиентом. Достаточно часто используется ацетонитрил с трифторуксусной кислотой.

Градиент. Градиент может быть линейным, нелинейным или включать ступенчатое изменение состава. Для разделения сложных смесей рекомендуется пологий градиент. Градиент оптимизируют, добиваясь четкого разрешения с 1 или 2 пиков, которые становятся "маркерными" пиками для испытания.

Изократическое элюирование. Изократическая ВЭЖХ с использованием подвижной фазой постоянного состава используется ввиду ее удобства и улучшенного аналитического сигнала детектора. В ряде случаев сложно подобрать оптимальный состав подвижной фазы, позволяющий добиться хорошего разрешения для каждого пика. Для проведения изократической ВЭЖХ не должны использоваться подвижные фазы, для которых незначительное изменение в соотношении компонентов или в значении pH существенно влияет на время удерживания пиков на пептидной карте.

Другие параметры. Для достижения хорошей воспроизводимости, как правило, требуется контроль температуры колонки. Скорость подвижной фазы варьируется от 0,1 мл/мин до 2,0 мл/мин, детектирование пептидов осуществляется спектрофотометрическим детектором при длине волны от 200 нм до 230 нм. Используются и другие методы детектирования (например, постколоночная дериватизация), но они не столь надежны и универсальны, как детектирование в ультрафиолетовой области.

Валидация. В данном разделе приводятся экспериментальные средства для оценки общих характеристик используемого метода. Критерии оценки пригодности системы зависят от определения критических параметров испытания, влияющих на интерпретацию данных и их приемлемость. Критические параметры являются также критериями, по которым производится контроль расщепления и анализа пептидов. Для контроля полноты требуемого расщепления используется сравнение со стандартным образцом, который был подвергнут такому же воздействию, как и испытуемый белок. Использование стандартного образца параллельно с испытуемым белком является критическим при разработке и установлении значений критериев оценки пригодности системы. Кроме этого, с целью дополнительного сравнения включается образец хроматограммы стандартного образца. Другие показатели могут включать визуальный контроль растворимости белка или пептидов, отсутствие интактного белка, измерение откликов трудно расщепляемых пептидов. Критические параметры оценки пригодности системы для пептидного анализа будут зависеть от конкретного используемого метода разделения и детектирования, а также требований к получаемым в результате анализа данным.

В случае, когда пептидное картирование используется в качестве испытания по идентификации, требования к пригодности системы для идентифицируемых пептидов включают избирательность и воспроизводимость. В этом случае, как и в случае идентификации отличающихся по составу белков, определение первичной структуры пептидных фрагментов при картировании обеспечивает как верификацию известной первичной структуры, так и идентификацию структуры отличающихся белков путем сравнения с пептидной картой стандартного образца для белка установленной структуры. Использование подвергнутого расщеплению стандартного образца при определении разделения пептидов и аминокислот является референтным методом. Для анализа отличающихся по составу белков может быть использована охарактеризованная по составу смесь отличающегося белка и стандартного образца, в особенности если отличные по составу белки находятся в зоне худшего разрешения на пептидной карте. Критерием выбора системы определения структуры белка может являться число основных определяемых пептидов. Критерии выбора системы для определения структуры белка лучшим образом определяются разрешением пиков пептидов. Хроматографические параметры, такие как разрешение между пиками, ширина пика у основания, площадь пика, степень размывания заднего фронта пика и эффективность колонки, могут быть использованы для определения разрешения пептидов. В зависимости от испытуемого белка и используемого метода разделения могут устанавливаться требования к разрешению одного или нескольких пептидов.

Повторный анализ продуктов расщепления стандартного образца для испытуемого белка позволяет установить количественные характеристики прецизионности и открываемости. Открываемость определяемых пептидов в целом устанавливается при помощи внутренних и внешних пептидных стандартов. Прецизионность выражается как относительное стандартное отклонение. Следует ожидать различий в извлечении и воспроизводимости идентифицируемого протеина; следовательно, критерии допуска для оценки пригодности системы должны быть установлены как для извлечения, так и для воспроизводимости идентифицируемых пептидов. Установленные критерии допуска являются специфическими для данного протеина и указываются в частной фармакопейной статье.

Визуальное сравнение относительных времен удерживания, параметров пиков (площади пика или высоты пика), числа пиков и в целом метода элюирования производится изначально. Оно дополняется и подтверждается математическим анализом соотношений анализируемых параметров пиков и хроматографического профиля смеси 1:1 (об/об) продуктов расщепления испытуемого образца и образца сравнения. Идентичность анализируемого образца подтверждается, если все пики продуктов расщепления анализируемого белка и стандартного образца имеют аналогичные времена удерживания и соотношения оцениваемых параметров пиков.

Если пики, которые изначально характеризовались значительно различающимися относительными временами удерживания, затем в смеси 1:1 обнаруживались единым пиком, изначально выявленное различие является показателем нестабильности системы. Однако если в смеси 1:1 наблюдаются разделенные пики, это является доказательством наличия различных пептидов в каждом из пиков. Если пик в смеси 1:1 существенно шире, чем соответствующий пик в анализируемом белке и стандартном образце, это может означать наличие различных пептидов. Было предложено использование компьютерной программы распознавания для анализа данных пептидного картирования, однако аспекты валидации компьютерной программы исключают ее использование в качестве справочного теста в ближайшем будущем. Использовались также иные автоматизированные подходы с использованием математических формул, моделей и систем распознавания. Одним из таких подходов, например, является автоматическое определение соединений методом ИК-спектроскопии и применение диодно-матричного УФ-спектрального анализа для идентификации пептидов. Данные методы имеют ограничения, обусловленные недостаточным разрешением, одновременным элюированием фрагментов, различиями в абсолютных значениях параметров пиков между продуктами расщепления анализируемого и стандартных образцов.

Можно произвести множественное сравнение времен удерживания и площадей или высоты пиков для выбранной группы соответствующих пиков, которые правильно идентифицируются на пептидной карте. Площади пиков могут быть рассчитаны с использованием одного пика, демонстрирующего относительно небольшую вариабельность в качестве внутреннего стандарта, с учетом того, что интегрирование площади пика является чувствительным к базовой вариабельности и может служить причиной ошибки анализа. Как альтернативный вариант для испытуемого образца может быть рассчитан процент высоты пика каждого пептида относительно суммы высоты всех пиков. Затем полученный процент сравнивается со значением аналогичного параметра соответствующего пика стандартного образца. Возможность автогидролиза трипсина контролируется при помощи создания пептидной карты-плацебо, получаемой при обработке трипсином раствора без определяемого белка.

Минимальным требованием для оценки качества пептидного картирования является принятая процедура тестирования, которая включает пригодность системы в качестве контроля. В целом на начальном этапе регуляторного процесса качественный анализ пептидной карты анализируемого белка является достаточным. С усовершенствованием процесса регуляторного одобрения белков дополнительные испытания по оценке качества могут включать частичную валидацию аналитической процедуры для обеспечения гарантии того, что метод будет произведен в соответствии с запланированным при разработке пептидной карты определяемого белка.

АНАЛИЗ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЕПТИДОВ

В данном разделе приведено руководство по использованию пептидного картирования при разработке частных фармакопейных статей и нормативных документов по качеству при регистрации лекарственных средств.

Использование пептидной карты как инструмента качественного определения не требует полной характеристики индивидуальных пептидных пиков. Однако валидация методики пептидного картирования при разработке частных фармакопейных статей и нормативных документов по качеству требует точной характеристики каждого из индивидуальных пиков пептидной карты. Для характеристики индивидуальных пиков могут быть использованы как метод N-концевого секвенирования с последующим анализом аминокислот, так и метод с использованием масс-спектроскопии.

Для составления характеристики пиков с использованием N-концевого секвенированияи аминокислотного анализа проводят масштабирование стадии аналитического разделения. Необходимо убедиться на основании эмпирических данных, что ухудшения разрешения между пиками вследствие проведения масштабирования не происходит. Элюаты, соответствующие специфическим пептидным пикам, собирают, концентрируют в вакууме и, при необходимости, повторно хроматографируют. Аминокислотный анализ фрагментов может быть ограничен размером пептидов. В случае если N-концевая аминокислота заблокирована, может потребоваться ее высвобождение до секвенирования. С целью получения характеристики может также использоваться C-концевое секвенирование белков в комбинации с карбоксипептидазой и методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с время пролетным масс-анализатором.

Использование масс-спектроскопии для характеристики пептидных фрагментов производится либо путем непосредственного введения выделенных пептидов, либо с использованием online системы ВЭЖХ с масс-спектрометром для структурного анализа. В целом он включает электрораспыление и масс-спектрометрию методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с время пролетным масс-анализатором, а также бомбардировку быстрыми атомами. Тандемная масс-спектроскопия также используется для определения последовательности модифицированных белков и типа произошедшей аминокислотной модификации. Сравнение масс-спектров продуктов гидролиза до и после восстановления обеспечивает определение расположения дисульфидных связей в различных сульфгидрилсодержащих пептидах.

Если некоторые части первичной структуры не могут быть достаточно четко отражены пептидной картой, может потребоваться составление вторичной пептидной карты. Целью валидированной методики для характеристики белка по средством пептидного картирования является определение как минимум 95% теоретического состава структуры белка.

2.1.2.40. Аминокислотный анализ

Аминокислотный анализ относится к методологии, используемой для определения аминокислотного состава или количественного содержания аминокислот в белках, пептидах и лекарственных препаратах. Белки и пептиды представляют собой макромолекулы, состоящие из ковалентно связанных остатков аминокислот, которые образуют линейные полимеры. Последовательность аминокислот в белках или пептидах определяет свойства молекулы. Белки представляют собой крупные молекулы, которые обычно существуют в виде сложных структур со специфической конформацией, в то время как пептиды имеют меньший размер и могут состоять только из нескольких аминокислот. Аминокислотный анализ может быть использован для количественного определения белков и пептидов, идентификации белков или пептидов на основе их аминокислотного состава, структурного анализа белков и пептидов, оценки стратегий фрагментации для картирования пептидных остатков и обнаружения атипичных аминокислот, которые могут присутствовать в белках или пептидах. Перед аминокислотным анализом необходимо гидролизовать белки/пептиды до получения отдельных аминокислотных составляющих. После гидролиза белков/пептидов процесс аминокислотного анализа может быть таким же, как и для свободных аминокислот в других лекарственных средствах. Аминокислотные составляющие испытуемого образца перед анализом обычно подвергаются химической модификации (или дериватизации).

ОБОРУДОВАНИЕ

Методы, используемые для аминокислотного анализа, обычно основаны на хроматографическом разделении аминокислот, присутствующих в испытуемом образце. Современные методики анализа основаны на использовании автоматизированных хроматографических приборов для решения аналитических задач. В качестве прибора для аминокислотного анализа обычно используют жидкостный хроматограф низкого или высокого давления, способный создавать градиентное элюирование подвижной фазой, что обеспечивает разделение анализируемых аминокислот на хроматографической колонке. Если анализ образца не осуществляется с использованием предколоночной дериватизации, прибор должен иметь устройство для постколоночной дериватизации. В качестве детектора обычно используется спектрофотометрический детектор в ультрафиолетовой/видимой области или флуоресцентный детектор в зависимости от используемого метода дериватизации. Регистрирующее устройство (например, интегратор) используется для преобразования аналогового сигнала из детектора и для проведения количественных вычислений. Предпочтительно, чтобы прибор использовался исключительно для аминокислотного анализа.

ОБЩИЕ МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

При выполнении аминокислотного анализа аналитик всегда должен учитывать возможность фонового загрязнения. Необходима высокая степень чистоты реактивов (например, низкая чистота хлороводородной кислоты может способствовать загрязнению глицина). Аналитические реактивы должны меняться регулярно каждые несколько недель, при этом должны использоваться только растворители класса "для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)". Возможное загрязнение микроорганизмами и посторонними частицами, которые могут присутствовать в растворителях, устраняется путем фильтрования этих растворителей перед применением, хранением растворителей в закрытых емкостях и размещением прибора для аминокислотного анализа в защищенном от прямого солнечного света месте.

Качество аминокислотного анализа определяется лабораторной практикой. Приборы размещают в местах наименьшего передвижения персонала. Лабораторию содержат в чистоте. Очищают и калибруют пипетки согласно графику. Наконечники пипеток хранят в закрытой коробке; аналитикам не позволяется трогать их незащищенными руками. Аналитик должен использовать неопудренные латексные или аналогичные перчатки. Ограничивают число открываний и закрываний флакона с испытуемым образцом, так как пыль может приводить к завышению результатов по содержанию глицина, серина и аланина.

Для получения удовлетворительных результатов аминокислотного анализа прибор необходимо обслуживать надлежащим образом. Если прибор используется по стандартной программе, он должен ежедневно проверяться на отсутствие протечки, стабильную работу детектора и ламп и способность колонки поддерживать необходимую степень разделения индивидуальных аминокислот. Согласно графику проводят очистку или замену всех фильтров прибора и другое техническое обслуживание.

СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ

Необходимые стандартные образцы аминокислот для проведения аминокислотного анализа коммерчески доступны и обычно представляют собой водный раствор смеси аминокислот. При определении аминокислотного состава наряду с испытуемым образцом анализируются стандартные образцы белков или пептидов, которые используются в качестве контроля для подтверждения полноты всего процесса. Для этой цели в качестве стандартного образца белка используют высокоочищенный бычий сывороточный альбумин.

КАЛИБРОВКА ПРИБОРА

Калибровка прибора для аминокислотного анализа обычно состоит в определении величины сигнала и рабочего диапазона концентраций для каждой аминокислоты с использованием стандартного образца, содержащего смесь разных концентраций аминокислот. Концентрация каждой аминокислоты в стандартном образце известна. В процессе калибровки при выполнении аминокислотного анализа стандартный образец разводят до различных концентраций анализируемого вещества в пределах предполагаемой области линейности согласно используемой аналитической методике. Затем анализируют растворы с различными концентрациями анализируемого вещества. По оси ординат наносят площади пиков каждой аминокислоты, а по оси абсцисс - соответствующие известные концентрации каждой аминокислоты с учетом разведений. Эти результаты позволяют определить область концентраций аминокислот, в которой зависимость площади пика данной аминокислоты от ее концентрации является линейной функцией. Важно, чтобы образцы для аминокислотного анализа были приготовлены таким образом, чтобы концентрации аминокислот в этих образцах находились в пределах аналитической области (т.е. в рабочей линейной области) используемой методики с целью получения точных и воспроизводимых результатов.

Для определения коэффициента сигнала каждой аминокислоты анализируют от 4 до 6 концентраций стандартного образца. Коэффициент сигнала рассчитывается как среднее значение площади или высоты пика на 1 нмоль (10-9 моль) аминокислоты, присутствующей в стандартном образце. Коэффициенты сигнала каждой аминокислоты используют для расчета концентрации каждой аминокислоты, представленной в испытуемом образце. Количество вещества (нмоль) анализируемой аминокислоты рассчитывают путем деления площади пика, соответствующего данной аминокислоте, на коэффициент сигнала этой аминокислоты. Для рутинного анализа может быть достаточно калибровки по одной точке; при этом калибровка по коэффициентам сигнала каждой аминокислоты должна часто обновляться и проверяться для контроля достоверности.

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Полный аминокислотный анализ требует от аналитической лаборатории контроля повторяемости результатов количественного определения. Во время хроматографического разделения аминокислот или их производных на хроматограмме наблюдается множество пиков, относящихся к аминокислотам. Большое количество пиков делает необходимым наличие программного обеспечения, способного неоднократно идентифицировать пики, основываясь на времени удерживания, и интегрировать площади пиков для количественных расчетов. Типичная оценка повторяемости включает приготовление стандартного раствора аминокислот и анализ многократных повторных вводов пробы (например, 6 или более повторных вводов) одного и того же стандартного раствора. Определяют относительное стандартное отклонение значений времени удерживания и интегрированной площади пика каждой аминокислоты. Оценку повторяемости дополняют включением многократных количественных определений, проводимых в течение нескольких дней разными аналитиками. Многократные количественные определения включают приготовление стандартных разведений из исходных материалов для определения различий результатов, возникающих из-за манипуляций с образцом. При оценке повторяемости часто проводят аминокислотный анализ состава стандартного образца белка (например, бычий сывороточный альбумин). На основе оценки относительных стандартных отклонений лаборатория рассчитывает аналитические пределы для подтверждения того, что анализы в данной лаборатории проведены надлежащим образом. Для гарантирования наилучших результатов желательно установить наименьшие практические пределы отклонений. Факторы, на которые следует обратить внимание для уменьшения отклонений в результатах аминокислотного анализа, включают приготовление образца, высокие фоновые спектральные помехи из-за качества реактивов и/или лабораторных манипуляций, работу и обслуживание приборов, анализ и интерпретацию данных, профессиональные качества аналитика и его состояние. Все параметры, о которых идет речь, должны всесторонне исследоваться в рамках проведение валидации.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦА

Точность результатов аминокислотного анализа требует использования очищенных образцов белков и пептидов. Компоненты буфера (например, соли, мочевина, детергенты) могут повлиять на аминокислотный анализ и должны удаляться из образца перед анализом. В методиках с использованием постколоночной дериватизацией аминокислот, компоненты буфера обычно не оказывают значимого влияния по сравнению с методиками с предколоночной дериватизацией. Желательно ограничить число операций с образцом для уменьшения потенциально возможного фонового загрязнения, улучшения открываемости анализируемого вещества и уменьшения трудозатрат. Общие технические приемы, которые используются для удаления компонентов буфера из образцов белка, включают следующие методы: (1) введение образца белка в обращенно-фазовую систему ВЭЖХ, удаление белка с помощью летучего растворителя, содержащего достаточное количество органического компонента, и высушивание образца в вакуумной центрифуге; (2) диализ с летучим буферным раствором или водой; (3) ультрафильтрационное центрифугирование для замены буфера летучим буферным раствором или водой; (4) осаждение белка из буферного раствора с использованием органического растворителя (например, ацетона); (5) гель-фильтрацию.

ВНУТРЕННИЕ СТАНДАРТЫ

Внутренний стандарт рекомендуется использовать для контроля физических и химических потерь и изменений в ходе аминокислотного анализа. Перед гидролизом к раствору белка может быть прибавлено точно известное количество внутреннего стандарта. Открываемость внутреннего стандарта указывает на общую открываемость аминокислот белкового раствора. Однако свободные аминокислоты ведут себя иначе, чем аминокислоты белка во время гидролиза, скорость высвобождения которых всегда разная. Поэтому использование внутреннего стандарта для введения поправки на потери в ходе гидролиза может давать недостоверные результаты, что необходимо учитывать при их интерпретации. Внутренние стандарты также могут добавляться к смеси аминокислот после гидролиза для введения поправки на различия во введениях пробы образца, на изменяющуюся стабильность реактивов и на отклонения скорости подвижной фазы. В идеальном случае в качестве внутреннего стандарта используют коммерчески доступную аминокислоту, которая отличается от природных аминокислот. Кроме того, внутренний стандарт должен быть стабильным в ходе гидролиза, его коэффициент сигнала должен иметь линейную зависимость от концентрации и выходить из хроматографической колонки со свойственным только этому стандарту временем удерживания без перекрывания пиков других аминокислот. Наиболее часто используемые стандартные образцы аминокислот включают норлейцин, нитротирозин и кислоту.

ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

Для аминокислотного анализа белков и пептидов необходимо проводить гидролиз. Лабораторная посуда, используемая для проведения гидролиза, должна быть очень чистой. Опудривающий порошок для перчаток, а также отпечатки пальцев на посуде, в которой проводится гидролиз, могут привести к загрязнению. Для очистки стеклянных пробирок для проведения гидролиза используют кипячение в течение 1 ч в 1 M растворе хлороводородной кислоты или замачивание в концентрированной азотной кислоте или в смеси из равных объемов концентрированных хлороводородной и азотной кислот. Чистые пробирки, используемые для гидролиза, промывают водой высокоочищенной, затем ополаскивают метанолом для хроматографии, сушат в сушильном шкафу в течение ночи и хранят закрытыми вплоть до использования. Для удаления загрязнения из пробирок, которые используются для гидролиза, также можно использовать прокаливание чистой стеклянной посуды при температуре 500 °C в течение 4 ч. Допускается использование соответствующих одноразовых лабораторных принадлежностей.

Кислотный гидролиз является наиболее часто используемым методом для расщепления белка перед проведением аминокислотного анализа. Метод кислотного гидролиза может повлиять на отклонение результатов анализа из-за полного или частичного разрушения некоторых аминокислот: триптофан разрушается, серин и треонин частично разрушаются, метионин может подвергаться окислению, а цистеин обычно определяется как цистин (но открываемость цистина обычно низкая вследствие частичного разрушения или восстановления до цистеина). Применение соответствующего вакуума (менее 200 мкм ртутного столба, или 26,7 Па) или введение инертного газа (аргона) в пространство реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной деструкции. В пептидных связях, образованных изолейцином и валином, амидные группы Иле-Иле, Вал-Вал, Иле-Вал и Вал-Иле гидролизуются частично; аспарагин и глутамин дезамидируются с образованием соответственно аспарагиновой и глутаминовой кислот. Потеря триптофана, аспарагина и глутамина в ходе кислотного гидролиза ограничивает количественное определение до 17 аминокислот. Некоторые из описанных ниже методов кислотного гидролиза используются для решения этих задач. Некоторые методы гидролиза (например, методы 4 - 11) могут приводить к превращениям в другие аминокислоты. Поэтому преимущества использования конкретной методики оцениваются относительно задач, решаемых с ее помощью, и всесторонне изучаются перед выбором методики, отличающейся от обычного кислотного гидролиза.

Для определения исходной концентрации аминокислот, которые частично разрушаются или медленно отщепляются, часто используют исследование гидролиза во времени (аминокислотный анализ при кислотном гидролизе в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч). Путем построения графика зависимости найденной концентрации лабильных аминокислот (например, серина и треонина) от времени гидролиза и экстраполяции полученной кривой к началу координат определяют исходную концентрацию этих аминокислот. Концентрацию остатков аминокислот, которые медленно отщепляются (например, изолейцин и валин), принимают равной высоте плато на полученном графике зависимости концентрации остатков от времени гидролиза. Если гидролиз будет протекать слишком долго, концентрация остатков аминокислот в образце начнет уменьшаться, что указывает на их разрушение при данных условиях гидролиза.

Приемлемой альтернативой исследованию гидролиза во времени является проведение гидролиза стандарта аминокислот с известными концентрациями в таких же условиях, что и для испытуемого образца. Аминокислоты в свободном состоянии не могут в полной мере отражать скорость деструкции при гидролизолабильных аминокислот, входящих в состав пептидов или белков. Это особенно справедливо для медленно расщепляющихся пептидных связей (например, связи Иле-Вал). Однако данная методика позволяет аналитику учесть лишь некоторую часть разрушающихся аминокислот. Возможно применение кислотного гидролиза с использованием микроволнового излучения, который отличается быстротой, но требует специального оборудования, а также специальных мер предосторожности. Оптимальные условия гидролиза с использованием микроволнового излучения должны быть установлены для каждого отдельного белкового/протеинового образца. Микроволновый гидролиз обычно протекает в течение нескольких минут, но отклонение даже в одну минуту может привести к неудовлетворительным результатам (например, неполный гидролиз или разрушение лабильных аминокислот). Полный протеолиз с применением смеси протеаз может быть слишком сложным, он требует надлежащего контроля и обычно более подходит для пептидов, чем для белков.

Для определения оптимальных условий в ходе первоначального анализа белка неизвестного состава проводятся эксперименты с различными временами гидролиза и при разных температурных режимах.

МЕТОД 1

Кислотный гидролиз с использованием хлороводородной кислоты, содержащей фенол, является наиболее общей процедурой, используемой для гидролиза белка/пептида при аминокислотном анализе. Добавление фенола предупреждает реакцию галогенирования тирозина.

Гидролизующий раствор. 6 M раствор хлороводородной кислоты, содержащий, от 0,1% до 1,0% фенола.

Методика

Жидкофазный гидролиз. Образец белка или пептида помещают в ампулу для гидролиза и высушивают (образец сушат для того, чтобы вода в образце не разбавляла кислоту, используемую для гидролиза). Прибавляют гидролизующий раствор из расчета 200 мкл на 500 мкг лиофилизированного белка. Образец в ампуле замораживают в бане с сухим льдом и ацетоном и запаивают в вакууме при помощи пламени. Образцы обычно гидролизуют при температуре 110 °C в течение 24 ч в вакууме или в атмосфере инертного газа для предотвращения окисления. Если есть подозрение, что испытуемый белок полностью не гидролизуется, рассматривают возможность проведения гидролиза в течение более продолжительного времени (например, 48 ч и 72 ч).

Парофазный гидролиз. Это один из наиболее общих методов кислотного гидролиза. Он предпочтителен для микроанализа, когда доступны лишь небольшие количества образца. При использовании парофазного гидролиза контаминация образца кислотными реактивами минимизирована. Флаконы с высушенными образцами помещают в сосуд, содержащий подходящее количество гидролизующего раствора. Гидролизующий раствор не должен контактировать с испытуемым образцом. В свободном пространстве сосуда создают инертную атмосферу или вакуум (менее 200 мкм ртутного столба, или 26,7 Па) и для проведения гидролиза нагревают при температуре около 110 °C в течение 24 ч. Пары кислоты гидролизуют сухой образец. Возможность конденсации кислоты во флаконах с образцом должна быть сведена к минимуму. После гидролиза испытуемый образец сушат в вакууме до удаления остатков кислоты.

МЕТОД 2

Использование меркаптоэтансульфоновой кислоты в качестве восстанавливающей кислоты уменьшает окисление триптофана в процессе гидролиза.

Гидролизующий раствор. 2,5 M раствор меркаптоэтансульфоновой кислоты.

Парофазный гидролиз. От 1 мкг до 100 мкг испытуемого белка/пептида сушат в ампуле для гидролиза. Ампулу помещают в большую ампулу, содержащую около 200 мкл гидролизующего раствора. Герметично запаивают большую ампулу в вакууме (около 50 мкм ртутного столба, или 6,7 Па). Нагревают ампулу для гидролиза до температуры от 170 °C до 185 °C в течение 12,5 мин. После гидролиза ампулу с образцом сушат в вакууме в течение 15 мин до удаления остатков кислоты.

МЕТОД 3

Использование тиогликолевой кислоты (ТГК) в качестве восстанавливающей кислоты предотвращает окисление триптофана при гидролизе.

Гидролизующий раствор. 7 M раствор хлороводородной кислоты, содержащий 1% фенола, 10% трифторуксусной кислоты и 20% тиогликолевой кислоты.

Парофазный гидролиз. От 10 мкг до 50 мкг испытуемого белка/пептида высушивают в ампуле для гидролиза. Ампулу для гидролиза помещают в большую ампулу, содержащую около 200 мкл гидролизующего раствора. Большую ампулу герметично запаивают в вакууме (около 50 мкм ртутного столба, или 6,7 Па). Нагревают ампулу для гидролиза до температуры 166 °C в течение 15 - 30 мин. После гидролиза для удаления остатков кислоты ампулу с образцом сушат в вакууме в течение 5 мин. Окрываемость триптофана в этом методе зависит от количества испытуемого образца.

МЕТОД 4

Перед гидролизом белка проводят окисление цистеина/цистина и метионина над муравьиной кислотой.

Окисляющий раствор. Смешивают 1 объем 30% раствора водорода пероксида и 9 объемов муравьиной кислоты безводной и выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Полученную надмуравьиную кислоту используют свежеприготовленной.

Методика. Образец белка/пептида растворяют в 20 мкл муравьиной кислоты безводной, нагревают при температуре 50 °C в течение 5 мин и прибавляют 100 мкл окисляющего раствора. Процесс окисления проводят в течение 10 - 30 мин. В данной реакции цистеин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин - в метионинсульфон. Избыток реактива удаляют из образца при помощи вакуумного центрифугирования. Окисленный белок может быть затем гидролизован по методу 1 или методу 2. При наличии галогенидов эта методика может приводить к модификации остатков тирозина.

МЕТОД 5

Окисление цистеина/цистина происходит во время жидкофазного гидролиза с натрия азидом.

Гидролизующий раствор. К 6 M раствору хлороводородной кислоты, содержащему 0,2% фенола, прибавляют натрия азид до получения конечной концентрации 2 г/л. Прибавление фенола предотвращает галогенирование тирозина.

Жидкофазный гидролиз. Гидролиз белка/пептида проводят при температуре около 110 °C в течение 24 ч. Во время гидролиза присутствующий в образце цистеин/цистин превращается в цистеиновую кислоту под воздействием натрия азида, содержащегося в гидролизном растворе. Эта методика приводит к лучшей открываемости тирозина, чем метод 4, но она не подходит для количественного определения метионина. Метионин превращается в смесь из метионина и двух продуктов его окисления - метионинсульфоксида и метионинсульфона.

МЕТОД 6

Окисление цистеина/цистина происходит под воздействием диметилсульфоксида (ДМСО).

Гидролизующий раствор. К 6 М раствору хлороводородной кислоты, содержащему от 0,1% до 1,0% фенола, прибавляют ДМСО до получения раствора с конечной концентрацией 2% (об/об).

Парофазный гидролиз. Гидролиз белка/пептида проводят при температуре около 110 °C в течение 24 ч. Во время гидролиза присутствующий в образце цистеин/цистин превращается в цистеиновую кислоту под воздействием ДМСО, содержащегося в гидролизном растворе. С целью ограничения разброса данных и компенсации частичного разрушения рекомендуется оценивать открываемость цистеиновой кислоты при окислительном гидролизе стандартного образца белка, содержащего 1 - 8 остатков цистеина. Коэффициент сигнала гидролизата белка/пептида обычно на 30% ниже, чем для негидролизованного стандартного образца цистеиновой кислоты. Так как гистидин, метионин, тирозин и триптофан также модифицируются, полный анализ состава при использовании этой методики невозможен.

МЕТОД 7

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при пиридилэтилировании в паровой фазе.

Восстанавливающий раствор. 83,3 мкл пиридина, 16,7 мкл 4-винилпиридина, 16,7 мкл трибутилфосфина и 83,3 мкл воды помещают в подходящий контейнер и перемешивают.

Методика. Ампулу для гидролиза с образцом белка/пептида (от 1 мкг до 100 мкг) помещают в большую ампулу. Переносят восстанавливающий раствор в большую ампулу, герметично запаивают в вакууме (около 50 мкм ртутного столба, или 6,7 Па) и нагревают при температуре около 100 °C в течение 5 мин. Затем внутреннюю ампулу для гидролиза помещают в вакуумный эксикатор и сушат в течение 15 мин для удаления остатков реактивов. Пиридилэтилированный образец затем гидролизуют согласно описанной ранее методике. Для оценки открываемости пиридилэтилцистеина параллельно проводят реакцию пиридилэтилирования стандартного образца белка, содержащего 1 - 8 остатков цистеина. Длительное время инкубации при реакции пиридилэтилирования может быть причиной модификации концевых и лизина в белке.

МЕТОД 8

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при пиридилэтилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 1 M раствор трис-гидрохлорида с pH 8,5, содержащий 0,004 M динатрияэдетата (исходный раствор A); 8 M раствор гуанидина гидрохлорида (исходный раствор B); 10% раствор 2-меркаптоэтанола (исходный раствор C).

Восстанавливающий раствор. Для получения буферного раствора 6 M раствора гуанидина гидрохлорида в 0,25 M растворе трис-гидрохлорида смешивают 1 объем исходного раствора A и 3 объема исходного раствора B.

Методика. Около 10 мкг испытуемого образца растворяют в 50 мкл восстанавливающего раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора C. Выдерживают при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона в течение 2 ч. Для проведения реакции пиридинэтилирования к раствору белка прибавляют около 2 мкл 4-винилпиридина и выдерживают дополнительно 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Обессоливают белок/пептид методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая белковую/пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования.

МЕТОД 9

Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при карбоксиметилировании в жидкой фазе.

Исходные растворы. Готовят как указано в Методе 8.

Раствор для карбоксиметилирования. Готовят раствор 100 г/л йодацетамида в 96% спирте.

Буферный раствор. Используют восстанавливающий раствор, приготовленный как указано в Методе 8.

Методика. Испытуемый образец растворяют в 50 мкл буферного раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора C. Выдерживают при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона в течение 2 ч. Прибавляют раствор для карбоксиметилирования в 1,5-кратном количестве от общего теоретического содержания тиолов, и выдерживают дополнительно в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Если содержание тиолов в белке неизвестно, прибавляют 5 мкл 0,1 M раствора йодацетамида на каждые 20 нмоль испытуемого образца белка. Для прекращения реакции прибавляют избыток 2-меркаптоэтанола. Обессоливают белок/пептид методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая белковую/пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования. В процессе кислотного гидролиза полученный S-карбоксиамидометилцистеин будет превращаться в S-карбоксиметилцистеин.

МЕТОД 10

Цистеин/цистин, прореагировавший с дитиогликолевой кислотой или дитиодипропионовой кислотой, образует смешанный дисульфид. Выбор дитиогликолевой кислоты или дитиодипропионовой кислоты зависит от требуемого разрешения методики аминокислотного анализа.

Восстанавливающий раствор. Раствор 10 г/л дитиогликолевой кислоты (или дитиодипропионовой кислоты) в 0,2 M растворе натрия гидроксида.

Методика. Около 20 мкг испытуемого образца помещают в ампулу для гидролиза и прибавляют 5 мкл восстанавливающего раствора. Прибавляют 10 мкл изопропилового спирта и удаляют всю жидкость из образца при помощи вакуумного центрифугирования. Образец гидролизуют, используя метод 1. Преимущество данного метода заключается в том, что остатки других аминокислот не участвуют в побочных реакциях, а образец не нуждается в обессоливании перед гидролизом.

МЕТОД 11

Аспарагин и глутамин в процессе кислотного гидролиза превращаются в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно. Остатки аспарагина и аспарагиновой кислоты обозначают как Asx, а остатки глутамина и глутаминовой кислоты обозначают как Glx. Белки/пептиды могут взаимодействовать с бис(1,1-трифторацетокси)йодбензолом (БТЙ), превращая при гидролизе остатки аспарагина и глутамина в остатки диаминопропионовой кислоты и диаминомасляной кислоты, соответственно. Эти превращения позволяют определять в белке/пептиде содержание аспарагина и глутамина в присутствии остатков аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.

Восстанавливающие растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 0,01 M раствор трифторуксусной кислоты (раствор A); 5 M раствор гуанидина гидрохлорида, содержащий 0,01 M трифторуксусной кислоты (раствор B); свежеприготовленный раствор диметилформамида, содержащий 36 мг/мл БТЙ (раствор C).

Методика. Около 200 мкг испытуемого образца помещают в чистую ампулу для гидролиза и прибавляют 2 мл раствора A или раствора B и 2 мл раствора C. Ампулу для гидролиза герметично запаивают в вакууме. Испытуемый образец нагревают при температуре 60 °C в течение 4 ч в защищенном от света месте. Затем образец подвергают диализу водой для удаления избытка реактивов. Диализированный образец трижды экстрагируют равными объемами бутилацетата и лиофилизируют. Белок может быть затем гидролизован согласно описанной ранее методике. Остатки , кислоты и , кислоты обычно не отделяются от остатков лизина ионообменной хроматографией, используемой при аминокислотном анализе. Таким образом, при использовании ионного обмена для разделения при аминокислотном анализе содержание аспарагина и глутамина представляет собой разницу между количественным содержанием аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты, полученным при кислотном гидролизе без дериватизации и с BTI-дериватизацией. Количественное содержание треонина, метионина, цистеина, тирозина и гистидина может изменяться при БТЙ-дериватизации; при необходимости определения этих аминокислотных остатков белка/пептида следует проводить гидролиз без БТЙ-дериватизации.

МЕТОДОЛОГИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО АНАЛИЗА: ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

Существует множество способов аминокислотного анализа. Выбор конкретного способа зачастую определяется требуемой чувствительностью количественного определения. В целом около половины применяемых способов аминокислотного анализа основаны на разделении свободных аминокислот посредством ионообменной хроматографии с последующей постколоночной дериватизацией (например, с нингидрином или o-фталевым альдегидом). Методы постколоночной дериватизации могут быть использованы для образцов, содержащих небольшое количество буферных компонентов (таких как соли и мочевина) и обычно требует от 5 мкг до 10 мкг испытуемого образца белка для проведения одного анализа. Остальные методы аминокислотного анализа обычно включают предколоночную дериватизацию свободных аминокислот (например, фенилизотиоцианатом; 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом или o-фталевым альдегидом; (диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом; 9-фторенилметилхлорформиатом; 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом) с последующим обращенно-фазовым ВЭЖХ анализом. Метод предколоночной дериватизации отличается высокой чувствительностью (обычно требуется от 0,5 мкг до 1,0 мкг испытуемого образца белка для проведения одного анализа), однако на него могут оказывать влияние компоненты солевого буфера, содержащиеся в испытуемом образце. Предколоночная дериватизация может привести к образованию производных одной аминокислоты, что приводит к усложнению интерпретации результатов.

Для количественного аминокислотного анализа могут быть использованы приведенные ниже методы. Приборы и реактивы для проведения этих испытаний коммерчески доступны. Кроме того, многие из этих методов имеют модификации с различным приготовлением реактивов, проведением химических реакций, различными хроматографическими системами и так далее. Специфические параметры могут отличаться в зависимости от конкретного оборудования и методики выполнения анализа. Многие лаборатории используют несколько методик аминокислотного анализа, так как каждая из них имеет свои преимущества. В каждой из этих методик аналоговый сигнал обнаруживается с помощью системы сбора данных, а площади пиков используются для количественного определения.

МЕТОД 1. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С НИНГИДРИНОМ

Ионообменная хроматография с постколоночной дериватизацией с нингидрином является одним из наиболее распространенных методов, предназначенных для количественного аминокислотного анализа. Как правило, для анализа большинства сложных физиологических образцов пригодной является катионообменная система на основе ионов лития, а быстрая катионообменная система на основе ионов натрия используется для более простых смесей аминокислот, полученных при гидролизе белков (обычно 17 аминокислот). Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается подбором pH и ионной силы. Для улучшения разделения часто используют температурный градиент.

При взаимодействии аминокислоты с нингидрином образуется продукт с характерным фиолетовым или желтым цветом. Аминокислоты, за исключением иминокислот, образуют продукт фиолетового цвета, имеющий максимум поглощения при 570 нм. Иминокислоты, такие как пролин, образуют продукт желтого цвета, имеющий максимум поглощения при 440 нм.

Продукты постколоночной реакции между нингидрином и элюируемыми из колонки аминокислотами детектируются при длинах волн 440 нм и 570 нм, а полученная хроматограмма используется для определения аминокислотного состава.

Предел обнаружения для большинства производных аминокислот обычно составляет 10 пмоль, а для производных пролина - 50 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20 - 500 пмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой более 1 мкг.

МЕТОД 2. ПОСТКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С O-ФТАЛЕВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

o-Фталевый альдегид (ОФА) реагирует с первичными аминами в присутствии тиольных соединений, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. Эта реакция используется для постколоночной дериватизации при аминокислотном анализе методом ионообменной хроматографии. Условия разделения такие же, как указано в методе 1.

Для образования флуоресцирующих производных с ОФА вторичные амины (иминокислоты, такие как пролин) предварительно окисляют натрия гипохлоритом или хлорамином T. В методике используются сильнокислотные катионообменные колонки для разделения свободных аминокислот с последующим постколоночным окислением натрия гипохлоритом или хлорамином T и постколоночной дериватизацией с использованием ОФА и тиольных соединений, таких как N-ацетил-L-цистеин или 2-меркаптоэтанол. Длительное воздействие натрия гипохлорита или хлорамина T не оказывает заметного влияния на дериватизацию первичных аминокислот.

Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается подбором pH и ионной силы. После постколоночной дериватизации элюируемых аминокислот с ОФА продукты реакции проходят через флуориметрический детектор. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных аминокислот измеряется при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине волны излучаемого света 450 нм.

Предел обнаружения для большинства ОФА-производных аминокислот обычно составляет несколько десятков пикомоль. Линейность сигнала наблюдается в области от нескольких пикомоль до нескольких десятков наномоль. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой более 500 нг.

МЕТОД 3. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С ФЕНИЛИЗОТИОЦИАНАТОМ

Фенилизотиоцианат (ФИТЦ) реагирует с аминокислотами с образованием фенилтиокарбамильных производных (ФТК-производных), которые могут быть обнаружены с высокой чувствительностью при длине волны 254 нм. Предколоночная дериватизация аминокислот с ФИТЦ проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-спектрофотометрическим детектированием.

После удаления реактива под вакуумом сухие замороженные производные аминокислот могут храниться без заметной деструкции в течение нескольких недель. Раствор пробы для введения может храниться в холодном месте в течение 3 дней без заметных изменений хроматографического сигнала.

Разделение ФТК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным достигается путем подбора концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. Элюируемые из колонки ФТК-производные аминокислот определяют при длине волны 254 нм.

Предел обнаружения для большинства ФТК-производных аминокислот обычно составляет 1 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20 - 500 пмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой более 500 нг.

МЕТОД 4. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 6-АМИНОХИНОЛИЛ-N-ГИДРОКСИСУКЦИНИМИДИЛКАРБАМАТОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом (АХК) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. АХК реагирует с аминокислотами с образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных производных мочевины (АХК-аминокислот), которые легко поддаются анализу методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

Разделение АХК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, достигается подбором концентрации ацетонитрила и ионной силы буферного раствора. Селективное флуоресцентное детектирование производных при длине волны возбуждающего света 250 нм и при длине волны излучаемого света 395 нм допускает прямой ввод реакционной смеси без каких-либо существенных поправок на основной флуоресцирующий побочный продукт - 6-аминохинолин. Избыток реактива быстро гидролизуется (t1/2 < 15 с) с образованием 6-аминохинолина, N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1 мин дальнейшее образование производных не происходит.

Площади пиков для АКХ-аминокислот, по существу, не изменяются, по меньшей мере, в течение 1 недели хранения растворов при комнатной температуре. Следовательно, АХК-аминокислоты обладают более чем достаточной стабильностью для проведения круглосуточного автоматического хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой аминокислоты, кроме цистеина, находится в области от 40 фмоль до 320 фмоль.

Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 2,5 - 500 мкмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется перед гидролизом использовать образцы белка/пептида массой более 30 нг.

МЕТОД 5. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С O-ФТАЛЕВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с o-фталевым альдегидом (ОФА) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Метод не позволяет определять аминокислоты, являющиеся вторичными аминами (например, пролин).

ОФА в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. В качестве тиольных соединений могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 3-меркаптопропионовая кислота. ОФА не обладает флуоресценцией и, следовательно, не образует мешающих пиков. Кроме того, его растворимость и стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяет проводить автоматическую дериватизацию с использованием автодозатора для смешивания испытуемого образца и реагента. Основным недостатком ОФА является отсутствие у него способности реагировать со вторичными аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток можно сочетанием с методиками, описанными в методах 7 или 8.

Предколоночная дериватизация аминокислот с ОФА используется для пробоподготовки перед обращенно-фазовой ВЭЖХ. Так как ОФА-производные аминокислот неустойчивы, анализ и разделение методом ВЭЖХ проводят немедленно после дериватизации. Хроматограф для жидкостной хроматографии должен быть оснащен флуометрическим детектором для обнаружения производных аминокислот. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных аминокислот измеряют при длине волны возбуждающего света 348 нм и длине волны излучаемого света 450 нм.

Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании не ниже 50 фмоль, однако на практике предел обнаружения составляет 1 пмоль.

МЕТОД 6. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С (ДИМЕТИЛАМИНО)-АЗОБЕНЗОЛСУЛЬФОНИЛХЛОРИДОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с (диметиламино)азобензолсульфонилхлоридом (ДАБС) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием в видимой области спектра.

ДАБС является хромофорным реактивом и используется для маркировки аминокислот. Аминокислоты, маркированные ДАБС (ДАБС-аминокислоты), обладают высокой стабильностью и проявляют максимум поглощения при 436 нм.

ДАБС-аминокислоты всех встречающихся в природе производных аминокислот могут быть разделены на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием градиентного элюирования и подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и водной буферной смеси. Элюируемые из колонки ДАБС-аминокислоты определяют при длине волны 436 нм.

Метод позволяет проводить с одинаковой чувствительностью анализ как аминокислот, так и иминокислот (таких как пролин). Метод дериватизации с ДАБС позволяет количественно определять остатки триптофана, полученные при гидролизе белка/пептида с сульфоновыми кислотами (такими как кислота меркаптоэтансульфоновая, кислота n-толуолсульфоновая или кислота метансульфоновая) как указано в методе 2, описанном в разделе "Гидролиз белков". Другие лабильные остатки аминокислот, такие как аспарагин и глутамин, можно анализировать как и предыдущие после превращения их в кислоту диаминопропионовую и кислоту диаминомасляную соответственно, как указано в методе 11, описанном в разделе "Гидролиз белков".

В качестве внутреннего стандарта для этого метода не может быть использован норлейцин, так как он элюируется в области хроматограммы со скоплением пиков первичных аминокислот. В качестве внутреннего стандарта может быть использован нитротирозин, который элюируется в свободной от пиков области хроматограммы.

Предел обнаружения ДАБС-аминокислот обычно составляет 1 пмоль. Предел определения ДАБС-аминокислот - 2 - 5 пмоль. Для получения удовлетворительных данных рекомендуется для одного анализа использовать 10 - 30 нг ДАБС-производных белкового гидролизата.

МЕТОД 7. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 9-ФТОРЕНИЛМЕТИЛХЛОРФОРМИАТОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 9-фторенилметилхлорформиатом (ФМФ) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

ФМФ взаимодействует с первичными и вторичными аминокислотами с образованием производных с сильной флуоресценцией. Реакция протекает в мягких условиях в водном растворе в течение 30 с. Полученные производные стабильны, за исключением подверженных деструкции производных гистидина. Несмотря на то, что ФМФ сам по себе обладает флуоресценцией, избыток ФМФ и флуоресцирующие побочные продукты реакции могут быть удалены без потерь ФМФ-аминокислот.

ФМФ-аминокислоты могут быть разделены на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Разделение проводят по программе градиентного элюирования с линейным изменением состава подвижной фазы от смеси ацетонитрил - метанол - ацетатный буферный раствор (10:40:50, об/об/об) до смеси ацетонитрил - ацетатный буферный раствор (50:50, об/об). В результате такого элюирования 20 производных аминокислот разделяются в течение 20 мин. Элюируемые из колонки производные аминокислот определяют при длине волны возбуждающего света 260 нм и длине волны излучаемого света 313 нм.

Предел обнаружения находится в нижнем фемтомолярном диапазоне. Линейность сигнала для большинства аминокислот наблюдается в области 0,1 - 50 мкмоль.

МЕТОД 8. ПРЕДКОЛОНОЧНАЯ ДЕРИВАТИЗАЦИЯ С 7-ФТОР-4-НИТРОБЕНЗО-2-ОКСА-1,3-ДИАЗОЛОМ

Предколоночная дериватизация аминокислот с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом (НБД) проводится перед разделением смеси аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.

НБД взаимодействует с первичными и вторичными аминокислотами с образованием производных с сильной флуоресценцией. Аминокислоты дериватизируются с НБД при нагревании до 60 °C в течение 5 мин.

НБД-производные аминокислот могут быть разделены на колонке, заполненной силикагелем октадецилсилильным, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием программы градиентного элюирования и подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и водной буферной смеси. В результате такого элюирования 17 производных аминокислот разделяются в течение 35 мин. В качестве внутреннего стандарта может быть использована кислота, которая элюируется в свободной от пиков области хроматограммы. Элюируемые из колонки производные аминокислот определяют при длине волны возбуждающего света 480 нм и длине волны излучаемого света 530 нм.

Чувствительность этого метода почти такая же, как в предколоночной дериватизации с ОФА (метод 5), за исключением пролина, который не реагирует с ОФА (преимущественное отличие метода с НБД). Предел обнаружения для каждой аминокислоты составляет около 10 фмоль. Анализ проводят с использованием 1,5 мг белкового гидролизата в предколоночной реакционной смеси.

РАСЧЕТ И АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ДАННЫХ

При определении содержания аминокислот в белковом/пептидном гидролизате следует учитывать, что при кислотном гидролизе триптофан и цистеин разрушаются, серин и треонин разрушаются частично, в то время как связи по остаткам изолейцина и валина расщепляются не полностью. Метионин во время кислотного гидролиза может подвергаться окислению, в результате чего появляются свободные аминокислоты (например, глицин и серин), загрязняющие образец. Использование вакуума (менее 200 мкм ртутного столба, или 26,7 Па) или введение инертного газа (аргон) в пространство реакционного сосуда может уменьшить степень окислительной деструкции. Поэтому количественные результаты, полученные для цистеина, триптофана, треонина, изолейцина, валина, метионина, глицина и серина из белкового/пептидного гидролизата, могут быть непостоянными и служить основанием для дальнейшего исследования и анализа.

Мольный процент аминокислоты - это количество остатков определенной аминокислоты на 100 остатков в белке. Эта величина может быть полезной при оценке данных, полученных при аминокислотном анализе, если молекулярная масса исследуемого белка неизвестна. Информация также может быть использована для подтверждения подлинности белка/пептида или для других целей. Мольный процент каждой аминокислоты в испытуемом образце рассчитывают по формуле:

где: rU - сигнал пика аминокислоты в испытуемом образце, проинтегрированный в наномолях

r - сумма сигналов пиков всех аминокислот в испытуемом образце, проинтегрированных в наномолях.

Сравнение полученного в испытании мольного процента аминокислот с данными известных белков может помочь установить или подтвердить подлинность испытуемого образца белка.

Образцы неизвестного белка. Этот метод расчета может быть использован для оценки концентрации белка в образце неизвестного белка с использованием данных, полученных при аминокислотном анализе. Массу каждой высвобождаемой аминокислоты рассчитывают в микрограммах по формуле:

где: m - количество аминокислоты, определенное в испытании, в наномолях;

Mr - средняя молекулярная масса данной аминокислоты, скорректированная с учетом массы молекулы воды, удаленной при образовании пептидной связи.

Суммируя массы высвобожденных аминокислот, получают общую массу анализируемого белка после соответствующей коррекции с учетом частично или полностью разрушенных аминокислот. Если известна молекулярная масса неизвестного белка (например, определенная методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатомили методом масс-спектрометрии), можно установить аминокислотный состав неизвестного белка. Число остатков каждой аминокислоты рассчитывают по формуле:

где: m - количество аминокислоты определенное в испытании, в наномолях

M - общая масса белка, в микрограммах

Mrt - молекулярная масса неизвестного белка.

Образцы известного белка. Этот метод расчета может быть использован для установления аминокислотного состава и концентрации белка в образце белка с известной молекулярной массой и аминокислотным составом с использованием данных, полученных при аминокислотном анализе. При анализе состава известного белка учитывают, что некоторые аминокислоты высвобождаются хорошо, в то время как открываемость других аминокислот может быть затруднена вследствие полного или частичного разрушения (например, триптофан, цистеин, треонин, серин, метионин), неполного расщепления связей (например, изолейцин и валин), контаминации свободными аминокислотами (например, глицин и серин).

Для определения количественного содержания белка используют аминокислоты, открываемость которых наилучшая. Хорошо открываемыми аминокислотами обычно являются: аспартат-аспарагин, глутамат-глутамин, аланин, лейцин, фенилаланин, лизин и аргинин. Этот перечень может изменяться на основании наработанного опыта по проведению анализа. Для определения количественного содержания белка по каждой хорошо открываемой аминокислоте количество каждой хорошо открываемой аминокислоты, в наномоль, делят на предполагаемое количество остатков этой аминокислоты в белке. Рассчитывают среднее значение содержания белка. Значения содержания белка, установленные по количеству каждой хорошо открываемой аминокислоты, должны быть равномерно распределены относительно среднего значения. В тех случаях, когда значения содержания белка, определенные по этим аминокислотам, имеют неприемлемые отклонения (обычно более 5%) от средней величины, их отбрасывают. С учетом оставшихся значений пересчитывают среднее содержание белка в испытуемом образце. Для определения аминокислотного состава испытуемого образца содержание каждой аминокислоты делят на рассчитанное среднее значение содержания белка. Относительную ошибку определения аминокислотного состава рассчитывают в процентах по формуле:

где: m - экспериментально установленное количество аминокислот в наномоль на аминокислотный остаток;

ms - известное значение остатков для этой аминокислоты.

Среднее значение относительной ошибки определения аминокислотного состава является средним значением абсолютных величин относительных ошибок определения каждой аминокислоты, обычно кроме расчета данных по триптофану и цистеину. Средняя величина относительной ошибки определения аминокислотного состава может дать важную информацию об устойчивости анализа во времени. Соответствие найденного аминокислотного состава образца белка и известного состава может служить подтверждением подлинности и чистоты белка в испытуемом образце.

2.1.2.41. Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой

ОБЩИЙ ПРИНЦИП

Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП) представляет собой метод атомно-эмиссионной спектрометрии, в котором в качестве источника возбуждения атомов используется индуктивно-связанная плазма (ИСП).

Индуктивно связанная плазма представляет собой сильно ионизированный инертный газ (обычно аргон) с одинаковым числом электронов и ионов, поддерживаемых радиочастотным (РЧ) полем. Высокая температура, достигнутая в плазме, последовательно десольватирует, превращает в пар, возбуждает (детектирование методом атомно-эмиссионной спектрометрии (АЭС)) и ионизирует (детектирование методом масс-спектрометрии (МС)) атомы испытуемого образца. Пределы обнаружения обычно находятся в диапазоне от менее нанограмма (МС-ИСП) до менее микрограмма (АЭС-ИСП) на литр.

Плазма формируется тангенциальным потоком поддерживающего газа через "горелку", т.е. систему, состоящую из трех концентрических кварцевых трубок. Металлическая катушка (индуктор) окружает верхний конец горелки и подсоединена к радиочастотному (РЧ) генератору. На катушку подается мощность (обычно 700 - 1500 Вт) и образуется переменное магнитное поле с частотой, соответствующей частоте генератора (в большинстве случаев 27 МГц, 40 МГц). Плазма образуется, когда газ-носитель становится проводящим и возникают первичные электроны и ионы. В индуцированном магнитном поле заряженные частицы (ионы и электроны) движутся по замкнутой кольцевой траектории. Из-за наличия сопротивления движению происходит разогревание, в результате которого появляется дальнейшая ионизация. Процесс происходит почти мгновенно, и плазма развивается до своих полных размеров и мощности. Радиочастотная осцилляция мощности, подающаяся на катушку, вызывает образование около верха горелки радиочастотных электрического и магнитного полей. Когда искра (продуцируемая либо трубкой Тесла, либо иным приспособлением) воздействует на газ-носитель, протекающий через горелку, из газа-носителя выбиваются некоторые электроны. Эти электроны подхватываются магнитным полем и ускоряются. Придание энергии электронам с помощью катушки называется индуктивным связыванием. Эти высокоэнергетические электроны сталкиваются с другими атомами газа-носителя, выбивая все больше электронов. Ионизация газа-носителя при столкновениях, происходящая в режиме цепной реакции, приводит к превращению газа в физическую плазму, состоящую из атомов газа-носителя, электронов и ионов газа-носителя. Плазма затем поддерживается между горелкой и катушкой постоянной подачей энергии с помощью процесса индуктивного связывания.

ИСП имеет вид интенсивной, очень яркой плазмы в виде факела. В основании плазма имеет тороидальную форму и этот участок называют зоной индукции (ЗИ), то есть областью, в которой индуктивная энергия передается от индуктора плазме. Образец вводится через ЗИ в центр плазмы.

ПРИБОР

Главными составляющими частями прибора являются:

- система ввода образца, состоящая из перистальтического насоса, подающего раствор с постоянной скоростью в распылитель;

- радиочастотный (РЧ) генератор;

- плазменная горелка;

- передающая оптика, фокусирующая изображение плазмы на входной щели спектрометра; радиальная проекция больше подходит для сложных матриц (щелочи, органические вещества), в то время как осевая проекция дает большую интенсивность и лучший предел определения в случае с простыми матрицами;

- дисперсионные устройства, состоящие из дифракционных решеток, призм, фильтров или интерферометров;

- детектор, превращающий энергию излучения в электрическую энергию;

- блок сбора данных.

ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

Интерференцией называется явление, вызывающее несоответствие аналитического сигнала элемента в образце сигналу элемента в калибровочном растворе такой же концентрации. Хорошо известная химическая интерференция, которая встречается в пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии, обычно слабо проявляется в АЭС-ИСП. В редких случаях, когда имеет место интерференция, для ее устранения может потребоваться увеличение мощности радиочастот или уменьшение потока внутреннего газа-носителя. Интерференция в АЭС-ИСП может быть спектрального происхождения или может быть результатом высоких концентраций определенных элементов или компонентов матрицы. Физическая интерференция (возникающая из-за различий в вязкости и поверхностном натяжении раствора образца и калибровочного раствора) может быть уменьшена путем разведения, подбора матрицы, использования внутренних стандартов или использованием метода стандартных добавок.

Другим типом интерференции, иногда встречающимся в АЭС-ИСП, является так называемый "эффект легко ионизируемых элементов". Легко ионизируемыми элементами называются элементы, которые ионизируются значительно легче, например, щелочные и щелочноземельные металлы. В образцах, которые содержат высокие концентрации таких элементов (более 0,1%) может происходить подавление либо увеличение эмиссии.

Спектральная интерференция. Она может происходить из-за присутствия других линий или сдвигов в интенсивности базовой линии. Эти линии могут соответствовать аргону (наблюдаются после 300 нм); OH линии, появляющиеся из-за разложения воды (около 300 нм); NO линии, появляющиеся из-за взаимодействия азота из окружающей среды с плазмой (между 200 нм и 300 нм); могут присутствовать линии других элементов, особенно тех, которые находятся в высокой концентрации в образце. Интерференция распадается на четыре различные категории: простой сдвиг базовой линии; наклонный сдвиг базовой линии; прямое спектральное наложение; сложный сдвиг базовой линии.

Абсорбционная интерференция. Данный вид интерференции возникает тогда, когда часть сигнала аналита поглощается до достижения детектора. В частности, этот эффект обнаруживается, когда концентрация элемента с сильной эмиссией настолько высока, что атомы или ионы этого элемента с более низкой энергией абсорбируют значительное количество излучения, испускаемого соответствующими возбужденными атомами или ионами. Этот эффект, называемый самопоглощением, предопределяет верхнюю границу линейного участка рабочего диапазона для данной длины волны эмиссии.

Многокомпонентный спектральный подбор. Во избежание проблем со спектральной интерференцией обычно проводят определение с использованием нескольких эмиссионных линий. Для более точной коррекции спектральной интерференции получают информацию с использованием усовершенствованной системы детекторов при помощи многокомпонентного спектрального подбора. Этот способ учитывает не только интерференцию, но также фоновый вклад матрицы, создавая, таким образом, формулу поправки. Многокомпонентный спектральный подбор использует модель множественных линейных квадратов, основанную на анализе чистого элемента, матрицы и контрольного раствора, создавая математическую модель с учетом интерференции. Это позволяет определять эмиссию элемента в сложной матрице с более низкими пределами детектирования и более высокой точностью.

МЕТОДИКА

ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ВВОД ОБРАЗЦА

Основной целью приготовления образца является обеспечение попадания концентрации элемента после использования разведения или концентрирования в рабочий диапазон прибора и получения раствора испытуемого образца, способного воспроизводимо распыляться.

Некоторые системы ввода образца устойчивы к действию высоких концентраций кислот, но использование серной и фосфорной кислот может способствовать фоновому излучению, наблюдаемому в спектрах ИСП. Более предпочтительным является использование азотной и хлороводородной кислот. Фтороводородную кислоту можно использовать при наличии устойчивых к ней (например, из перфторалкоксиполимера) систем ввода образца и горелок. При выборе метода ввода образца учитывают требования по чувствительности, стабильности, скорости, размеру образца, устойчивости к коррозии и устойчивости к закупорке. В большинстве случаев подходит использование распылителя с поперечным потоком вместе с распылительной камерой и горелкой. Перистальтическиие насосы, использующиеся в АЭС-ИСП, обычно подают стандартный и испытуемый растворы со скоростью 1 мл/мин или менее.

В случае использования органических растворителей следует учитывать необходимость введения кислорода для предупреждения образования органических слоев.

ВЫБОР УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

При выборе условий проведения анализа следуют рекомендациям производителя прибора. Анализ водных растворов и органических растворителей обычно происходит при различных условиях. Надлежащим образом должны быть выбраны следующие аналитические параметры:

- длины волн;

- скорости потоков газа-носителя (внешняя, промежуточная и внутренняя трубки горелки);

- мощность радиочастотного излучения;

- положение для наблюдения (радиальное или аксиальное);

- скорость насоса;

- условия для детектора (усиление/напряжение - для детектора с фотоумножающей трубкой, другие - для матричного детектора);

- время интегрирования (установленное время для измерения интенсивности эмиссии на каждой длине волны).

КОНТРОЛЬ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ПРИБОРА

Пригодность системы

Для подтверждения надлежащей работы АЭС-ИСП прибора с использованием многоэлементного раствора могут быть проведены следующие испытания:

- передача энергии (генератор, горелка, плазма); может быть использовано соотношение Mg II (280,270 нм)/Mg I (285,213 нм);

- подача образца, путем проверки эффективности и стабильности распылителя;

- разрешение (оптическая система), путем измерения ширины пика на половине высоты, например, для As (189,042 нм), Mn (257,610 нм), Cu (324,745 нм) или Ba (455,403 нм);

- аналитические характеристики, путем расчета пределов обнаружения выбранных элементов в данном диапазоне длин волн.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА

Через определенные временные интервалы верифицируют удовлетворительное исполнение метода, описанного в частной фармакопейной статье.

ЛИНЕЙНОСТЬ

Готовят и анализируют не менее четырех растворов сравнения, концентрация которых находится в пределах диапазона калибровки, и контрольный раствор. Проводят не менее пяти повторных определений.

Используя все полученные данные, рассчитывают калибровочную кривую методом регрессии наименьших квадратов. Строят кривую регрессии, отмечая средние значения, измеренные значения и доверительный интервал калибровочной кривой. Методика является пригодной при условии соблюдения следующих требований:

- коэффициент корреляции составляет не менее 0,99;

- на калибровочном графике погрешности каждого калибровочного уровня должны быть распределены случайным образом.

Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня.

В случае если отношение рассчитанного стандартного отклонения наименьшего и наибольшего калибровочного уровня менее 0,5 или более 2,0, то более точная оценка калибровочного графика может быть получена с использованием взвешенной линейной регрессии. Линейная и квадратичная весовая функции применяются к полученным данным для нахождения наиболее подходящей для использования весовой функции. Если способы сравнения с калибровочной кривой выявляют отклонение от линейности, используют двумерную линейную регрессию.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Предпочтительно верифицировать правильность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываемость.

Открываемость. Для методик количественного определения открываемость должна быть от 90% до 110%. Испытание считается недействительным, если, например, при определении микроэлементов, открываемость выходит за пределы от 80% до 120% от теоретического значения. Открываемость может быть определена на подходящем растворе сравнения (матричном растворе), в который добавляют известное количество анализируемого элемента (в диапазоне концентраций, который соответствует испытуемым образцам).

СХОДИМОСТЬ

Сходимость должна быть не более 3% для количественного определения и не более 5% для испытания на содержание примесей.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Удостоверяются, что предел количественного определения (например, определенный с использованием приближения ) ниже измеряемого значения.

2.1.2.42. Температура плавления - инструментальный метод

В общей фармакопейной статье описано измерение температуры плавления капиллярным методом с использованием инструментального метода определения.

ПРИБОР

Существуют два способа автоматической регистрации:

- способ A: измерение пропускания света через капиллярную трубку, заполненную образцом;

- способ B: измерение отражения света от образца в капиллярной трубке.

В обоих способах капиллярную трубку помещают в полость металлического блока с электрическим нагревом и контролируют с помощью температурного датчика, размещенного в другой полости металлического блока. Нагревательный элемент в блоке способен поддерживать заданную температуру с точностью до +/- 0,1 °C, а также обеспечивать медленный и постоянный подъем температуры со скоростью нагрева 1 °C/мин после начального изотермического периода.

В способе A луч света проходит через горизонтальную полость в нагревательном блоке и пересекает капиллярную трубку. Датчик регистрирует луч в конце цилиндрического отверстия за капиллярной трубкой.

В способе B луч света освещает капиллярную трубку спереди, а датчик записывает отраженный сигнал.

Некоторые модели приборов позволяют проводить визуальное определение точки плавления.

Температуру, при которой сигнал датчика впервые меняет свое начальное значение, считают началом плавления, а температуру, при которой сигнал датчика достигает своего конечного значения - концом плавления, или температурой плавления.

Используют стеклянные капиллярные трубки открытые с одного конца, длиной около 100 мм, наружным диаметром 1,3 - 1,5 мм и внутренним диаметром 0,8 - 1,3 мм. Толщина стенки капиллярной трубки составляет 0,1 - 0,3 мм.

Некоторые модели приборов позволяют определять температуру плавления более чем на одной капиллярной трубке.

МЕТОДИКА

Испытуемый образец, предварительно обработанный согласно указаниям в частной фармакопейной статье, помещают в капиллярную трубку в количестве, достаточном для формирования плотного столбика высотой около 4 мм в каждой капиллярной трубке и выдерживают в течение определенного времени при температуре, указанной в частной фармакопейной статье.

Далее поступают в соответствии с инструкцией производителей приборов или следующим образом. Нагревают нагревательный блок до температуры примерно на 5 °C ниже ожидаемой температуры плавления. Помещают капиллярную трубку в нагревательный блок запаянным концом вниз. Включают температурную программу. Когда испытуемый образец начинает плавиться, изменяется его внешний вид в капиллярной трубке, в результате чего после изменения сигнала фотодатчика, обусловленного пропусканием света (рисунок 2.1.2.42.-1) или изменением отражения (рисунок 2.1.2.42.-2), автоматически будет записана температура нагревательного блока.

Рисунок 2.1.2.42.-1. - Способ A - пропускание. A. Стеклянная капиллярная трубка; B. Испытуемый образец; C. Фотодатчик; D. Температурный датчик; E. Нагревательный блок; F. Источник света.

Рисунок 2.1.2.42.-2. - Способ B - отражение. A. Стеклянная капиллярная трубка; B. Испытуемый образец; C. Датчик изображения; D. Температурный датчик; E. Нагревательный блок; F. Источник света; G. Прозрачная пластинка.

Проводят испытание еще для двух других образцов и рассчитывают среднее значение по трем результатам.

КАЛИБРОВКА

Температурная шкала прибора периодически проверяется путем измерения температуры плавления сертифицированных стандартных образцов. Для этого используют капиллярные трубки таких же размеров, что и при измерении температуры плавления испытуемых образцов (см. "Прибор").

Готовят три капиллярные трубки для каждого из не менее двух сертифицированных стандартных образцов. Проводят испытание и рассчитывают среднее значение трех определений для каждого стандартного образца.

ПРИГОДНОСТЬ СИСТЕМЫ

В дополнение к калибровке перед измерениями проводят верификацию с использованием подходящего сертифицированного стандартного образца с температурой плавления, близкой к предполагаемому значению температуры плавления вещества.

Готовят три капиллярные трубки, проводят испытание и рассчитывают среднее значение трех определений.

Среднее значение должно находиться в пределах допустимых отклонений, указанных в сертификате, прилагаемом к сертифицированному стандартному образцу.

2.1.2.43. Обнаружение и измерение радиоактивности

ВВЕДЕНИЕ

В контексте фармакопеи понятие "радиоактивность" применяется для описания явления радиоактивного распада и выражения физической величины данного явления. В частных фармакопейных статьях на радиофармацевтические лекарственные препараты (РФЛП) обнаружение и измерение радиоактивности проводят с различными целями: подтверждение характеристик, идентификация, определение радионуклидной и радиохимической чистоты, а также определение радиоактивности вещества (количественное определение).

Исходя из вышеуказанного, измерение может быть качественным, количественным или и тем и другим в зависимости от того, направлено оно на идентификацию радионуклида или определение его активности (скорости распада), или имеет одновременно обе цели.

В соответствии с радионуклидным составом радиоактивные источники могут испускать различные типы излучений, такие как альфа-частицы, электроны, позитроны, гамма- и рентгеновское излучение.

Каждый радионуклид испускает характерные излучения с определенными значениями энергий и относительных интенсивностей. Подобные излучения могут быть обнаружены без дальнейшего определения их характеристик в ионизационной камере в результате проявления ионизирующих свойств; при их обнаружении и анализе с использованием спектрометра получают спектр значений энергии. Детальный спектральный анализ обычно применяют для идентификации радионуклидов, присутствующих в образце. Спектрометрия может также применяться для количественного определения радиоактивности источников, состоящих из одного радионуклида или смеси радионуклидов, или присутствующих радионуклидов по отдельности.

Измерение радиоактивности обычно осуществляется путем подсчета числа обнаруженных явлений распада (эмиссий). При этом геометрия образца в процессе измерения радиоактивности и время определения оказывают сильное влияние на результат. В общем случае геометрия измерения должна соответствовать геометрии при калибровке, а время определения должно быть достаточно длительным для получения статистически достоверных данных.

Измерение радиоактивности может быть осуществлено автономно (например, с использованием ионизационной камеры или спектрометра) или в комбинации с методом разделения (например, радиохроматография) для расчета относительных вкладов различных радиоактивных химических форм, присутствующих в смеси.

ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ

Если известна схема распада радионуклида, может проводиться прямое определение радиоактивности испытуемого образца в беккерелях (Бк), но на практике для получения точных результатов требуется внесение большого количества поправок. В связи с этим допускается возможность проводить измерение с помощью первичного стандартного источника или используя измерительные приборы, такие как ионизационная камера или спектрометр, калиброванные с использованием подходящих стандартов для конкретных радионуклидов.

Спектрометр используют при измерении радиоактивности радионуклидов в смеси, идентифицируя каждый радионуклид по его излучениям и характерным значениям энергий.

Все измерения радиоактивности должны корректироваться с учетом мертвого времени детектора, фонового излучения, связанного с окружающей средой и ложными сигналами, создаваемыми оборудованием.

Радиоактивность лекарственного препарата устанавливают на определенную дату. Если период полураспада радионуклида составляет менее 70 суток, также указывают время для конкретного временного (часового) пояса. Радиоактивность для других значений времени может быть рассчитана из экспоненциального уравнения распада или из таблиц.

Обычно правильное измерение радиоактивности требует учета некоторых или всех следующих позиций.

Потери на мертвое время. В связи с ограниченным временем разрешения (мертвое время) детектора и соединенного с ним электронного оборудования может быть необходимым внесение поправок на потери при совпадениях. Время разрешения счетчика представляет собой минимальный временной интервал, необходимый счетчику для разрешения двух отдельно регистрируемых импульсов. Эпизодические явления излучения в более короткие интервалы времени могут не обнаруживаться или обнаруживаться как отдельное явление с суммарной энергией. Эти потери иногда называются "потерями на мертвое время". Для подсчитывающей системы с фиксированным мертвым временем (после каждого счета истинную скорость счета, c-1, рассчитывают по следующей формуле:

где: N1 - наблюдаемая скорость счета в секунду;

- мертвое время в секундах.

Некоторые приборы вносят данную поправку автоматически. Внесение поправок на потери, вызванные совпадениями, должно быть сделано перед поправками на фоновое излучение.

Поправки на распад, происходящий в процессе измерения. Если период времени для отдельного измерения (tm) не настолько мал, что им можно пренебречь по сравнению с периодом полураспада радионуклида T1/2, необходимо учитывать распад, происходящий в процессе измерения. Например, 5% суммарных потерь при счете вследствие распада в течение периода измерения составляет 15% от периода полураспада радионуклида.

Показание прибора (скорость счета, ионизационный ток и т.д.), откорректированное с учетом фоновых сигналов и при необходимости потерь, вызванных электронными эффектами, на начало отдельного измерения рассчитывают по следующей формуле:

где: R - показание прибора перед внесением поправки на распад, но после поправки на фоновый сигнал и т.д.;

- константа распада радионуклида (ln 2/T1/2);

e - основание натурального логарифма;

tm - продолжительность измерения.

Статистика измерения радиоактивности. Различия в результатах определений радиоактивности происходят, главным образом, из хаотичной природы ядерных превращений. С помощью счета при любом ограниченном периоде времени можно только оценить истинную скорость ядерных превращений. Для компенсации различий в числе превращений за период времени должно регистрироваться достаточное количество импульсов. В случае измерения радиоактивности стандартное отклонение зарегистрированных импульсов равно корню квадратному из числа этих импульсов. Таким образом, для получения относительного стандартного отклонения, не превышающего 1%, необходимо не менее 10 000 импульсов.

Линейность. Линейность измерительного прибора представляет собой диапазон значений радиоактивности конкретного радионуклида, в пределах которого его эффективность остается постоянной.

Линейный диапазон значений совокупного измерения радиоактивности может быть определен при повторном счете для радиоактивного образца в условиях фиксированной геометрии, так как радионуклид образца распадается, начиная с уровня значений активности, превышающего линейный диапазон. После внесения поправок на фоновый сигнал строят график зависимости натурального логарифма значений скорости счета от времени, прошедшего после первого измерения (рисунок 2.1.2.43.-1).

Рисунок 2.1.2.43.-1. - График зависимости измеренной и экстраполированной скорости счета (натуральный логарифм числа импульсов в секунду (ln cps)) при использовании источника, содержащего технеций-99м, от времени, начиная с уровня значений радиоактивности, превышающих линейный диапазон измерительного оборудования

Линейный регрессионный анализ центральной линейной части совокупности данных приводит к наклону кривой, который равен постоянной распада , имеющей характерное значение для каждого радионуклида:

где: c - натуральный логарифм скорости счета при t = 0 совершенно линейного измерительного прибора.

Итоговое уравнение регрессии используют для расчета теоретической скорости счета при каждом значении времени, при котором были зарегистрированы текущие показания прибора. Линейный диапазон измерительного оборудования является превышенным в случае, если отклонение измеренной скорости счета от теоретической неприемлемо высокое.

С другой стороны, может быть произведен ряд разбавлений раствора радиоактивного вещества с известной радиоактивностью. Затем отмеряют равные объемы каждого разбавленного раствора и подвергают счету с использованием стандартизованных геометрии и комплектации счетчика. Отношение скорости счета для каждого образца (после поправки на фоновые сигналы и распад) к рассчитанной радиоактивности соответствующего образца в Бк представляет собой эффективность счета. Диапазон, в пределах которого это отношение имеет постоянное значение, является диапазоном измерительного оборудования, подходящим для данного радионуклида.

Предел обнаружения и предел количественного определения для оборудования и методик, используемых при измерении радиоактивности, должны устанавливаться перед их повседневным использованием.

Предел обнаружения. Предел обнаружения (ПО) отдельной методики представляет собой наименьшее содержание радиоактивности в образце, которое может быть обнаружено, но не обязательно определено количественно в виде точного значения. На практике для этого необходимо определить фоновый сигнал и его стандартное отклонение. ПО обычно принимается равным трехкратному стандартному отклонению фонового сигнала.

Предел количественного определения. Предел количественного определения (ПКО) отдельной методики представляет собой наименьшее содержание радиоактивности в образце, которое может быть определено количественно с соответствующей прецизионностью и правильностью. ПКО применяется, в частности, для определения примесей и/или продуктов деградации. На практике ПКО обычно принимается равным 10-кратному стандартному отклонению фонового сигнала.

ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИОНИЗАЦИОННОЙ КАМЕРЫ

Прибор. В практической радиофармации для измерения радиоактивности чаще всего применяют ионизационные камеры (включая калибраторы дозы). Прибор в большинстве случаев может измерять радиоактивность от нескольких десятков кБк до сотен ГБк и обычно содержит плотно закрытую ионизационную камеру с колодцем и встроенное компьютерное оборудование для преобразования сигнала детектора в единицы радиоактивности.

Камеру заполняют газом, на который накладывают электрическое поле. После ионизации газа под действием излучения, испускаемого источником, результирующий ионизационный ток измеряют и соотносят с радиоактивностью в ионизационной камере. Прикладываемое напряжение, энергия, интенсивность излучения, природа и давление газа оказывают влияние на ионизационный ток. Установки прибора (фактор калибровки) могут быть отрегулированы для создания прямой зависимости между ионизацией в результате излучения конкретного радионуклида и значением радиоактивности, полученным для каждой геометрии измерения.

Ионизационная камера измеряет только результирующий ток, возникающий в итоге ионизации внутри камеры, и не может различать излучения различных радионуклидов.

Для точного измерения радиоактивности отдельного радионуклида в измерение должны быть внесены поправки на вклады в ионизационный ток примесей радионуклидов, присутствующих в лекарственном препарате. Измеряемые уровни активности зависят от насыщения, диапазона усилителя и конструкции камеры. Диапазон линейности ионизационной камеры устанавливают, как описано выше в подразделе "Линейность".

Ионизационная камера должна быть экранирована для минимизации фоновых сигналов до приемлемого уровня.

Метод. Образец размещают внутри колодца ионизационной камеры в заданном положении, используя держатель. После помещения образца в ионизационную камеру и достижения стабильного сигнала регистрируют значение активности. Для получения наиболее правильных результатов измерение активности образца и калибровочного источника должны быть проведены в абсолютно идентичной геометрии. При необходимости доводят объем лекарственного препарата, радиоактивность которого необходимо измерить, до объема калибровочного источника.

Калибровка. Ионизационную камеру калибруют с учетом формы, размеров, материала первичной упаковки, объема и состава раствора, положения внутри камеры измеряемого радионуклида. Значения пределов неопределенности при калибровке можно найти в государственных (национальных) или международных нормативных документах.

Ионизационную камеру калибруют не менее одного раза в год используя радионуклидные источники, соответствующие государственным (национальным) или международным стандартам, в первичной упаковке (флакон, шприц), подходящей по геометрии. Устанавливают и применяют дополнительные поправочные коэффициенты для учета различия в конфигурациях образцов измеряемых радионуклидов. Выполняют контроль линейности сигнала прибора в пределах всего диапазона значений энергии и активности, для измерения которых применяется данное оборудование.

Для подтверждения калиброванного состояния ионизационной камеры для каждой установки параметра и перед каждым применением (как минимум один раз в день применения) проводят проверку стабильности ионизационной камеры с использованием стандартных радионуклидных источников с длительным периодом полураспада.

В день применения ионизационной камеры для подтверждения калибровки должна выполняться проверка на соответствие источнику сравнения, например, цезию-137.

ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТВЕРДОТЕЛЬНЫХ ДЕТЕКТОРОВ

К твердотельным детекторам относятся полимерные флуоресцентные и кристаллические сцинтилляторы, а также полупроводники. Кроме их использования в спектрометрии, как описано в разделе "Спектрометрия", твердотельные детекторы могут применяться для измерения радиоактивности. В частности, в связи с их высокой чувствительностью полимерные и кристаллические сцинтилляционные детекторы применяют при счете низких уровней радиоактивности. Потери на мертвое время должны быть тщательно изучены для всех типов детекторов. Полупроводниковые детекторы применяют при необходимости более точного измерения энергии излучения, например, в случае измерения радиоактивности смесей радионуклидов или если предполагаемые примесные радионуклиды имеют близкие значения энергии излучения.

Прибор. Прибор состоит из экранированного детектора, содержащего присоединенный к усилителю и электронно-вычислительным устройствам полимерный или кристаллический сцинтиллятор, соединенный с фотоумножителем, или полупроводник. Система может иметь регулируемое энергетическое окно для выбора, при необходимости, оператором требуемого для счета диапазона в спектре энергий. Измерительные приборы имеют различные параметры разрешения по энергии и эффективности обнаружения, зависящие от типа детектора, его объемных и геометрических характеристик. Чем меньше эффективность, тем больше необходимое время счета.

Измеряемые образцы должны быть помещены перед детектором или внутрь колодца детектора. Камеры измерения могут быть закрыты устройством для экранирования детектора, а введение образцов по отдельности может осуществляться с использованием крышки или других систем, позволяющих размещать образцы в определенном положении для обеспечения правильной геометрии измерения.

Сцинтилляционный детектор может применяться для измерения радиоактивности в динамическом режиме, например, в случае, когда элюат из жидкостного хроматографа направляется над детектором или через него, как описано в разделе, посвященном обнаружению и измерению радиоактивности в сочетании с методами разделения (определение радиохимической чистоты).

Метод. Необходимо удостовериться, что радиоактивность образца находится в диапазоне линейности оборудования. Измерение начинают после того, как все защитные экраны находятся на месте или крышка колодца возвращена в исходное положение и время счета выбрано таким образом, чтобы получить число импульсов, достаточное для проведения необходимой статистической обработки.

Калибровка. Калибровка детектора должна осуществляться измерением его эффективности с использованием радионуклидного источника, соответствующего государственным (национальным) или международным стандартам. При калибровке, исходя из эффективности, используют такие источники, как цезий-137, кобальт-60, барий-133 и другие, в соответствии с необходимым диапазоном значений энергии.

ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЖИДКОСТНЫХ СЦИНТИЛЛЯЦИОННЫХ ДЕТЕКТОРОВ

Жидкостной сцинтиллятор обычно используют для образцов, испускающих бета-частицы, но также и для образцов, испускающих альфа-частицы. Принципы обнаружения радиоактивности с использованием жидкостных сцинтилляционных детекторов описаны в подразделе "Бета-спектрометрия".

Калибровка. Для учета потери эффективности счета в связи с поглощением жидкостной сцинтилляционный счетчик может использовать внешний источник, обычно барий-133 или европий-152, который подносится близко к флакону с образцом для высвобождения электронов Комптона. Форму результирующего спектра анализируют автоматически для вычисления параметра, характеризующего поглощение. Затем этот параметр может иметь отношение к источникам измерения эффективности счета с известной активностью при определенном содержании поглотителя. Полученная кривая поглощения позволяет определить активность неизвестного образца при известных значениях скорости счета и параметра поглощения.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРИОДА ПОЛУРАСПАДА

Период полураспада является характеристикой радионуклида, которая может применяться для его идентификации. Период полураспада рассчитывают путем измерения изменения радиоактивности испытуемого образца как функции времени. Измерения выполняют в диапазоне линейности калиброванного измерительного прибора.

Прибор. Период полураспада может измеряться с использованием любого типа детектора для количественного определения радиоактивности при условии, что он используется в пределах диапазона линейности на протяжении всего диапазона значений радиоактивности, характерного для данного измерения, а геометрия не изменяется в процессе измерения.

Для лекарственных препаратов, содержащих радионуклид с коротким периодом полураспада, определение приблизительного значения периода полураспада, если это указано в частной фармакопейной статье, является частью идентификации (установление подлинности по радионуклиду).

Метод

Период полураспада. Испытуемый лекарственный препарат используют в том виде, в котором он представлен, или разбавляют, или высушивают в капсуле после соответствующего разбавления. Радиоактивный образец готовят таким образом, чтобы избежать потери вещества при работе с ним. Если радиоактивный образец представляет собой жидкость (раствор), его хранят в закрытой колбе или плотно закрытой пробирке. Если образец представляет собой остаток после высушивания в капсуле, его помещают в упаковку, состоящую из слоя клейкой ацетилцеллюлозы или каких-либо других материалов.

Радиоактивность образца должна быть достаточно высокой, чтобы обеспечить проведение измерений в течение 3 периодов полураспада, но для каждого измерения она должна находиться в пределах диапазона линейности оборудования. При необходимости проводят внесение поправок на потери на мертвое время.

Измерение одного и того же источника выполняют в идентичных условиях геометрии и с интервалами обычно не менее половины предполагаемого периода полураспада. Каждое значение вносят в таблицу напротив временного интервала, начиная с первоначального измерения. Во избежание влияния распада в процессе измерения время счета поддерживают одинаковым для всех измерений.

Строят график, откладывая на оси абсцисс значения времени, а на оси ординат - логарифм соответствующих показаний прибора (например, скорость счета). Период полураспада рассчитывают, по наклону линейного участка кривой измеренных значений относительно значений времени, соответствующих каждому измерению.

Приблизительное значение периода полураспада. Для его определения выполняют не менее трех измерений в течение не менее 1/4 предполагаемого периода полураспада.

Испытуемый образец и используемый измерительный прибор должны соответствовать изложенным выше требованиям. Обработку данных осуществляют описанным выше способом.

СПЕКТРОМЕТРИЯ

Радионуклиды могут быть идентифицированы по их спектру излучений. Получение спектра каждого типа излучений (например, альфа-частицы, бета-частицы и электроны, гамма- и рентгеновское излучения) требует определенного оборудования. Для обеспечения надлежащей работы спектрометры должны быть откалиброваны. Описание различного измерительного оборудования и детальное изложение основных методик для надежного измерения приводятся в следующих разделах.

ГАММА-СПЕКТРОМЕТРИЯ

Основные принципы. В гамма-спектрометрии с использованием сцинтилляционного детектора поглощение гамма- и рентгеновского излучения приводит к образованию света, который преобразуется с помощью фотоумножителя в электрический импульс. В гамма-спектрометрии с использованием полупроводникового детектора поглощение гамма- и рентгеновского излучения приводит к незамедлительному образованию электрического импульса.

В обоих случаях амплитуда импульса пропорциональна энергии поглощенного излучения. Наиболее распространенными детекторами для гамма- и рентгеновской спектрометрии являются сцинтилляционные счетчики на основе активированного таллием натрия йодида (NaI(Tl)) и полупроводниковые детекторы на основе высокочистого германия (HPGe).

Спектр гамма-излучения может быть образован при получении и анализе достаточного числа импульсов.

Прибор. Гамма-спектрометр обычно содержит экранированную измерительную камеру, в которую помещают образец, детектор, электрическую цепь и многоканальный анализатор.

Экранирование камеры должно уменьшать фоновый сигнал до уровня, позволяющего осуществлять регистрацию правильного спектра гамма-излучения.

Измерительная камера имеет подвижную крышку или выдвижной ящик, позволяющие разместить образец. Может применяться держатель образца для обеспечения воспроизводимости геометрии между измерениями.

Продолжительность измерения зависит от радиоактивности конкретного радионуклида, и для достижения необходимой статистики счета может потребоваться длительный период получения результата. Должны быть тщательно рассмотрены потери на мертвое время для данного типа детектора.

Чувствительность детектора на основе NaI(Tl) выше, чем у германиевого детектора того же размера. Обычно пики на спектре значений энергии идентифицируют с неопределенностью в зависимости от значений ширины пика на половине его высоты. Разрешение по энергии сцинтилляционного твердотельного детектора намного хуже, чем для полупроводникового детектора и, следовательно, пики, полученные при использовании полупроводникового детектора, намного уже, чем в случае применения сцинтилляционного детектора. На рисунке 2.1.2.43.-2 показано сравнение спектров, полученных с использованием одного и того же источника с двумя типами детекторов.

Рисунок 2.1.2.43.-2. - Сравнительные амплитудные спектры импульсов, полученные с использованием сцинтиллятора на основе натрия йодида, активированного таллием (верхняя кривая), и полупроводникового детектора на основе высокочистого германия (нижняя кривая). В качестве источника использовано гамма- и рентгеновское излучение, полученное в результате распада йода-131

Различные характеристики детекторов на основе NaI(Tl) и HPGe могут ограничивать их применение в некоторых спектрометрических анализах.

Для идентификации радионуклида(ов) в РФЛП и определения радионуклидной чистоты оценка риска процесса производства радионуклида должна включать в себя оценку возможного присутствия других радионуклидов со значениями энергии фотона в диапазоне (+/- 10%), характерном также и для радионуклида(ов), присутствующего(их) в РФЛП.

В случае присутствия радионуклидных примесей, которые испускают гамма- или рентгеновское излучения с энергией в диапазоне значений, также характерном и для фотонов, испускаемых радионуклидом лекарственного препарата, для идентификации пика достаточной является измеренная энергия пика, находящаяся в пределах максимального интервала значений +/- 2 кэВ или +/- 2% (тот пик, который больше) по отношению к номинальной энергии пика (см. общую фармакопейную статью Физические характеристики радионуклидов, указанных в фармакопее).

В случае если не предполагается присутствие таких примесей, для идентификации пика приемлемым является максимальный интервал +/- 10 кэВ или +/- 6% (тот пик, который больше) по отношению к номинальной энергии пика.

Метод. Необходимо обеспечить, чтобы скорость счета образца находилась в пределах диапазона линейности оборудования. Для жидких образцов этого можно достичь с помощью соответствующего разбавления; для твердых образцов - изменением расстояния между источником и детектором или применением растворителя. Испытуемый лекарственный препарат в первичной упаковке вносят в камеру измерительного оборудования и снимают спектр.

Необходимо обеспечить, чтобы контейнер, применяемый для количественных измерений, был идентичен по форме, размерам, объему и материалу контейнеру с калибровочным стандартом.

Необходимо обеспечить идентичность радионуклидного состава образца (по энергиям) в контейнере и его положения в измерительной камере контейнеру с калибровочным стандартом для количественного определения.

Идентификация радионуклида (Установление подлинности по радионуклиду). Калибруют спектрометр по энергии. Установление соответствия энергии пиков, обнаруженных для образца, значениям энергии, указанным в частной фармакопейной статье, подтверждает подлинность радионуклида в испытании.

Радионуклидная чистота. Калибруют спектрометр по эффективности и энергии. Определяют ПКО и разрешение измерительного оборудования. Полученные значения должны соответствовать предельным содержаниям определяемых радионуклидов. Снимают спектр лекарственного препарата.

Идентифицируют радионуклиды, присутствующие в испытуемом лекарственном препарате, и определяют их радиоактивность, используя общую фармакопейную статью Физические характеристики радионуклидов, указанных в фармакопее. В связи с тем, что содержание радионуклидных примесей, выраженное в процентах от общей радиоактивности, может возрастать или уменьшаться со временем, измеренная активность каждой примеси должна пересчитываться на активность на начало и конец срока годности лекарственного препарата. Активности всех радионуклидных примесей необходимо суммировать (принимая во внимание предел количественного определения) для получения общей радиоактивности лекарственного препарата.

Образец размещают близко к детектору или внутри детектора с колодцем. Все результаты в пределах диапазона заданных значений энергии собирают и выводят на дисплей измерителя скорости в виде числа импульсов в секунду или накапливают в течение заданного периода времени. В случае достаточного различия значений энергии фотонов, испускаемых радионуклидом(ами), может использоваться детектор на основе натрия йодида при установлении его высокой чувствительности. Однако при необходимости установления различия излучений со сходными значениями энергии следует применять детектор на основе HPGe или другой полупроводниковый детектор.

Калибровка. Калибровка по энергии осуществляется с использованием пиков известных источников, соответствующих государственным (национальным) или международным стандартам, например, кобальта-57, цезия-137, кобальта-60 и других, имеющих необходимый диапазон энергий. Параллельно может быть проведена калибровка по эффективности с целью получения не только спектра значений энергии, но в дальнейшем также и значений активности образца и радионуклидных примесей. Калибровка по эффективности может выполняться с применением стандартного радионуклидного источника с соответствующим диапазоном спектра энергий.

Для получения кривой эффективности измерение сигнала детектора как функции энергии, должно проводиться в определенной геометрии образец/детектор. В связи с этим возможно проводить измерение с помощью стандартного эталонного источника. Стандартные эталонные источники могут быть неподходящими для радионуклидов с коротким периодом полураспада, например, некоторых излучателей позитронов. При измерении образец должен преимущественно находиться в первичной упаковке и занимать определенное положение по отношению к детектору. В этом случае геометрия образец/детектор определяется положением образца относительно детектора и характеристиками контейнера и образца, например, формой, объемом и плотностью. На рисунке 2.1.2.43.-3 показана типичная кривая эффективности для детектора на основе HPGe, полученная для контейнера цилиндрической формы, помещенного наверху детектора.

Рисунок 2.1.2.43.-3. - Типичная кривая эффективности для детектора на основе HPGe, полученная при применении специального контейнера, помещенного наверху детектора

БЕТА-СПЕКТРОМЕТРИЯ

В случае бета-излучателя необходимо, чтобы бета-спектрометр определял распределение испускаемых бета-частиц по энергиям. Он аналогичен гамма-спектрометру, но в нем часто используется жидкостной сцинтиллятор для преобразования энергии бета-частиц в свет, который можно обнаружить и затем проанализировать. Бета-спектрометрия заключается преимущественно в растворении или суспендировании образца в жидкой сцинтилляционной смеси в прозрачных или полупрозрачных (стеклянных или полимерных) емкостях и последующем счете электрических импульсов, образованных с помощью фотоумножителя из излучаемого света. Амплитуда импульса зависит от энергии поглощенного излучения. Спектр бета-частиц может быть получен при образовании достаточного числа импульсов. Жидкую сцинтилляционную смесь выбирают таким образом, чтобы минимизировать ошибки счета вследствие поглощения, хемилюминесценции, фосфоресценции и т.д. Счет совпадений при использовании двух или более фотоумножителей также используют для минимизации числа импульсов, к которым приводят фоновое излучение, электронные эффекты и т.д. Для выявления различия между эмиссиями альфа- и бета-частиц обычно дифференцируют импульсы по форме.

Идентификация радионуклида. Установление соответствия на спектре энергии средних и/или максимальных значений энергии, полученных для образца, значениям энергии, указанным в частной фармакопейной статье, подтверждает подлинность радионуклида в испытании.

Калибровка. Общепринятым методом калибровки по энергии является применение непоглощающего образца сравнения для определения максимального значения энергии бетачастиц, испускаемых определяемым радионуклидом.

АЛЬФА-СПЕКТРОМЕТРИЯ

Для идентификации и количественного определения альфа-излучателей чаще всего применяют спектрометрию с использованием жидкостного сцинтилляционного детектора. Принцип изложен в предыдущем разделе, посвященном бета-спектрометрии.

Для идентификации и определения радионуклидной чистоты альфа-излучателей может применяться спектрометрия с использованием полупроводникового детектора на кремниевых диодах. При использовании такого детектора поглощение альфа-частиц приводит к незамедлительному образованию электрического импульса. Движение электронно-дырочных пар, образованных при воздействии излучения, индуцирует электрический заряд, который усиливают и измеряют.

Подготовка образца является исключительно важной. После химического отделения определяемого радионуклида образец наносится как электролитическое покрытие на диск из нержавеющей стали в виде очень тонкого слоя вещества для минимизации собственной абсорбции. Результативность всей процедуры может определяться экспериментально с добавлением известного количества индикатора, который должен учитывать эффективность разделения, эффективность нанесения электролитического покрытия и эффективность счета.

Для обоих типов детекторов амплитуда импульса зависит от энергии поглощенного излучения. Спектр альфа-частиц может быть получен при образовании достаточного количества импульсов.

Идентификация радионуклида. Установление соответствия энергии пиков, обнаруженных для образца, значениям энергии, указанным в частной фармакопейной статье, подтверждает подлинность радионуклида в испытании.

Калибровка. Альфа-спектрометр должен быть откалиброван по энергии и эффективности. Калибровка осуществляется с использованием пиков известных источников, имеющих необходимый диапазон значений энергии, таких как америций-241 и плутоний-242. Не все альфа-частицы, испускаемые источником, будут образовывать импульс в системе. Вероятность того, что испускаемые альфа-частицы будут взаимодействовать с материалом детектора и образовывать импульс, характеризует эффективность детектора, зависящую от геометрии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАДИОХИМИЧЕСКОЙ ЧИСТОТЫ

РФЛП может содержать радионуклид в различных химических формах, отличных от необходимой. Поэтому следует разделить различные вещества, содержащие радионуклид, и определить их относительную радиоактивность. Для этого приборы для обнаружения и измерения радиоактивности используют в сочетании с физико-химическими методами разделения. В принципе может быть использован любой метод разделения.

Частные фармакопейные статьи на РФЛП могут включать совместное применение метода измерения радиоактивности и методов хроматографии на бумаге (2.1.2.25), тонкослойной хроматографии (2.1.2.26), газовой хроматографии (2.1.2.27), высокоэффективной жидкостной хроматографии (2.1.2.28), эксклюзионной хроматографии (2.1.2.29) или электрофореза (2.1.2.30).

Во всех случаях радиоактивность каждого анализируемого образца измеряют после разделения, проведенного указанным методом.

Измерение радиоактивности может выполняться с применением детекторов, смонтированных последовательно с другими детекторами в аналитических измерительных приборах, например, жидкостных хроматографах с осуществлением поточного ("in-line") обнаружения радиоактивности испытуемых образцов, или выполняться автономно ("off-line"), то есть после завершения аналитического разделения путем измерения радиоактивности фракций элюата, полученных после разделения с помощью жидкостной хроматографии или в виде распределения по радиоактивности на полосках (пластинах) в бумажной или тонкослойной хроматографии.

НЕПРЕРЫВНОЕ ("IN-LINE") ОБНАРУЖЕНИЕ И ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ В СОЧЕТАНИИ С ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Прибор. Высокоэффективна жидкостная хроматография (2.1.2.28) может применяться для отделения основного радиоактивного вещества радиофармацевтического препарата от радиохимических примесей или продуктов деградации. Непрерывное ("in-line") обнаружение обычно проводят с помощью проточного сцинтилляционного детектора, соединенного с измерителем скорости и регистрирующим устройством. Сцинтилляционный материал детектора выбирают, исходя из типа обнаруживаемого излучения, например, полимерный сцинтиллятор - для бета-частиц или сцинтилляционные кристаллы - для гамма- и рентгеновского излучений. Для обнаружения в потоке радионуклидов, испускающих бета-частицы, может также использоваться добавление жидкой сцинтилляционной смеси перед достижением элюатом детектора.

Одновременное использование детектора радиоактивного излучения и других детекторов (ультрафиолетового, рефрактометрического, кондуктометрического и т.д.), соединенных последовательно, может применяться для идентификации вещества, например, по времени удерживания известного стандарта, для определения количества вещества с использованием подходящего стандартного образца и для измерения радиоактивности данного вещества. При последовательном соединении разных детекторов необходимо откорректировать экспериментально полученные значения времени удерживания с учетом задержки во времени между детекторами.

В жидкостной хроматографии некоторые радиохимические примеси, например, коллоидные примеси, могут удерживаться в колонке. В подобных случаях необходим отдельный метод для определения содержания удержанных радиохимических примесей, а расчетная формула для общей радиохимической чистоты должна учитывать относительное содержание удержанных радиохимических примесей.

Для оценки подобного удерживания в процессе валидации методики можно определить выход радиоактивности элюата из колонки путем измерения общей радиоактивности, полученной с помощью хроматографического оборудования с колонкой и без нее.

Метод. Образец разбавляют при необходимости и затем вносят в колонку в указанном объеме и при указанных условиях. В данном случае важно подтвердить ПО, ПКО, а также линейность детектора в пределах всего диапазона измеряемых значений активности.

Проточный детектор. Часть трубки, через которую движется элюат, содержащий радиоактивные компоненты, помещается перед детектором или внутри него. Эффективность счета можно повысить, используя более длинную часть трубки (например, осуществляя многократные повороты перед детектором или внутри него); однако это будет уменьшать способность системы к разделению двух близко расположенных элюируемых пиков радиоактивности.

При указании в испытании на радиохимическую чистоту определения общего содержания радиохимических примесей или количественного определения отдельной примеси важно выбрать соответствующие пороговые значения и подходящие условия для интегрирования площадей пиков. В подобных испытаниях не учитываемый предел, то есть предел, при котором или ниже которого пик не учитывается, зависит от методики и относится к пределу количественного определения. Таким образом, пороговые значения в системе сбора данных соответствуют не менее чем половине не учитываемого предела.

Сигнал детекторов регистрируют как функцию времени.

Идентификация пиков по радиометрическому сигналу (радиохроматограмма) осуществляют на основании времени удерживания анализируемых образцов. Для этой цели может быть использован профиль, полученный с помощью других детекторов.

Количественное определение различных компонентов профилей хроматограммы и радиохроматограммы проводят, исходя из площадей пиков. Площади пиков обычно получают непосредственным интегрированием сигнала детектора с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

АВТОНОМНОЕ ("OFF-LINE") ОБНАРУЖЕНИЕ И ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (2.1.2.28). При условии воспроизводимой последовательности времен удерживания различных радиохимических веществ применяется альтернативный метод количественного определения радиоактивности, заключающийся в сборе элюата в жидкостной хроматографии в виде выходящих во времени порций (фракций) для автономного (off-line) определения радиоактивности. Радиоактивность фракций, соответствующих пикам, может быть выражена в виде относительной части в процентах от общей радиоактивности всех фракций с учетом предела количественного определения.

Метод. Образец вносят в колонку в указанном объеме и при указанных условиях. Фракции собирают на конечной стадии хроматографирования.

Измеряют объем между детектором, используемым для идентификации времени удерживания пиков, и местом сбора фракций, а фактор удерживания рассчитывают на основании скорости потока элюата и используют для оценки времени элюирования для каждого пика в месте сбора. Фракции собирают с учетом фиксированного интервала времени или в момент выхода, определенный исходя из времени удерживания таким образом, чтобы любой из рассматриваемых пиков относился к одной или более фракциям.

Радиоактивность каждой фракции измеряют с использованием калиброванного средства измерения, например, калибратора доз или сцинтилляционного детектора, с учетом предела количественного определения и линейности.

Профиль элюирования получают в результате графической обработки данных таблицы, в которой количество импульсов, соответствующее одной фракции, вносится напротив времени элюирования или объема. Для определения радиохимической чистоты значения активности фракций, относящихся к одному и тому же пику, суммируют и рассчитывают относительное процентное содержание.

Тонкослойная хроматография (2.1.2.26) и хроматография на бумаге (2.1.2.25). При условии валидированности методик тонкослойной хроматографии или бумажной хроматографии для разделения компонентов радиоактивного препарата число и относительная интенсивность разделенных пятен могут обнаруживаться и измеряться с использованием детектора радиоактивности.

Расположение пятен (пиков) дает возможность провести химическую идентификацию при сравнении с растворами этих же химических веществ (нерадиоактивных), используя соответствующий метод детектирования.

Прибор

Сканирующее устройство. Прибор обычно содержит детектор радиоактивности, например, позиционно-чувствительный пропорциональный счетчик или коллимированный сцинтилляционный детектор, размещенный на фиксированном расстоянии от платформы, на которой располагается сканируемая хроматографическая пластина (полоска).

Радиоактивность образца, наносимого на хроматографическую полоску, должна быть такой, чтобы значение скорости счета находилось в диапазоне линейности измерительного оборудования, поэтому при необходимости образец может быть разбавлен. Сканируемая область размещается в соответствующем положении таким образом, чтобы необходимая полоса находилась на одной линии с траекторией сканирования детектора. Необходимо откорректировать время сканирования для обеспечения достаточного времени счета в течение единичного анализа.

Детектор или платформа могут перемещаться в плоскости вдоль оси x или оси y таким образом, чтобы вся поверхность полностью была просканирована в течение одного анализа.

Детектор соединяется с соответствующим счетным устройством, чтобы можно было провести количественное измерение детектируемой радиоактивности и соотнести пространственно скорость счета со сканируемой поверхностью.

Протокол с результатами измерения радиоактивности по отношению к пройденному детектором расстоянию выводится автоматически, а профиль содержит пики с площадью, пропорциональной числу импульсов на единицу расстояния.

Счетчик радиоактивности. В случае если необходимо идентифицировать не более трех полностью разделенных радиохимических компонентов, пластина (полоска) может быть разрезана на равные участки, каждый из которых имеет размер, не превышающий половину длины пластины (полоски) в соответствии с различием факторов разделения (Rf) двух наиболее близко расположенных пятен. Каждый отдельный участок нумеруют от начального края и подвергают счету по отдельности. С другой стороны, для хорошо характеризуемых систем полоска может быть разрезана на две или более неравные части, размеры которых перед счетом, при необходимости, могут быть откорректированы. Для измерений могут быть использованы ионизационная камера или сцинтилляционный счетчик при условии их применения в пределах диапазона линейности измерительного оборудования и свыше его ПКО.

Авторадиография. Авторадиография также может быть использована для получения изображения распределения радиоактивности на хроматографической полоске. В этом случае необходимо показать, что сигнал системы, применяемой для получения изображения, например, люминофорной системы формирования изображения или фотопленки, является линейным по отношению к радиоактивности, представленной на хроматограмме. В ином случае систему необходимо калибровать повторно или параллельно подвергнуть действию серии радиоактивных источников сравнения, полученной разбавлением калибровочного стандартного раствора в диапазоне предполагаемых значений радиоактивности компонентов, которые могут присутствовать на подложке.

Метод. Помещают необходимое количество образца на стартовую линию хроматографической полоски, высушивая, при необходимости, во избежание расплывания пятна. Хроматографирование осуществляют согласно указанному методу. Допускается использование носителя, если указано в частной фармакопейной статье.

В бумажной и тонкослойной хроматографии предпочтительно не разбавлять испытуемый лекарственный препарат, но важно избегать нанесения вещества с таким количеством радиоактивности, которое в процессе ее измерения обусловливает потери при счете в связи с совпадениями (потери на мертвое время).

После разделения полоску высушивают и определяют расположение радиоактивных участков путем измерения радиоактивности на протяжении всей хроматограммы, используя соответствующий коллимированный счетчик, с помощью авторадиографии или разрезанием полосок на части и измерением радиоактивности каждой части.

Суммарная радиоактивность может быть определена путем интегрирования с использованием автоматизированного измерительного прибора или счетчика с цифровой индикацией.

Из отношения площадей пиков получают отношение значений радиоактивности в процентах для соответствующих радиоактивных веществ.

Если полоски разрезаются на части, из отношения измеренных значений радиоактивности определяют отношение значений радиоактивности в процентах для соответствующих радиоактивных веществ.

Калибровка. Подтверждение пределов обнаружения и количественного определения, а также линейности детектора во всем диапазоне измеряемых значений активности и для всех положений на подложке хроматографической системы имеет важное значение. С этой целью применяют образцы со значениями активности от 0,1% до 100% от предполагаемого диапазона. Образцы готовят разбавлением и применяют их равные объемы, высушивая при необходимости. После получения профиля радиоактивности с использованием стандартного измерительного оборудования, площади пиков интегрируют для сравнения с рассчитанным количеством радиоактивности каждого пятна. Контролируют, чтобы чувствительность детектора на всей поверхности измерений была одинакова, так как она может отличаться в зависимости от положения детектора.

На разрешение пиков влияют размер пятна, общая радиоактивность радионуклида и технические возможности детектора. Это может быть проверено при нанесении пятен объемом 5 мкл, разделенных расстоянием, возрастающим от 4 мм до 20 мм, и с шагом 2 мм. Приблизительное разрешение системы обнаружения может определяться, исходя из профиля радиоактивности, как расстояние между двумя пятнами, где базовая линия является четко выделенной.

2.1.2.44. Температура каплепадения

(введен решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 25.10.2022 N 150)

Температура каплепадения представляет собой температуру, при которой в условиях, приведенных ниже, первая капля расплавленного испытуемого образца падает из чашки.

Определение температуры каплепадения проводят для образцов, не растирающихся в порошок и плавящихся ниже температуры кипения воды, таких, как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству применяют метод 1. Замена метода 1 на метод 2 должна быть подтверждена данными по валидации.

МЕТОД 1

Прибор. Для проведения испытания используют прибор, представленный на рисунке 2.1.2.44.-1. Прибор состоит из двух металлических гильз (А и Б), соединенных одна с другой посредством резьбы. Гильза А прикреплена к ртутному термометру. В нижней части гильзы Б с помощью двух уплотнителей Д свободно закреплена металлическая чашка Е. Точное положение чашки определяется фиксаторами Г длиной 2 мм, используемыми также для центровки термометра. Отверстие В в стенке гильзы Б предназначено для выравнивания давления. Отводящая поверхность чашки должна быть плоской, а края выходного отверстия - под прямым углом к поверхности. Нижняя часть ртутного термометра имеет форму и размер, как показано на рисунке 2.1.2.44.-1; пределы измерения термометра от 0 °C до 110 °C, расстояние на шкале в 1 мм соответствует разности температур в 1 °C. Шарик термометра имеет диаметр (3,5 +/- 0,2) мм и высоту (6,0 +/- 0,3) мм.

Рисунок 2.1.2.44.-1. - Прибор для определения температуры каплепадения. Размеры в миллиметрах. А - верхняя металлическая гильза; Б - нижняя металлическая гильза; В - отверстие для уравновешивания давления; Г - фиксаторы; Д - уплотнители; Е - металлическая чашка

Прибор устанавливают по оси пробирки длиной около 200 мм и наружным диаметром около 40 мм.

Прибор прикрепляют к пробирке с помощью пробки, в которую вставлен термометр и которая имеет боковую прорезь. Отверстие чашки должно находиться на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. Все устройство погружают в стакан вместимостью около 1 л, заполненный водой. Дно пробирки должно находиться на расстоянии около 25 мм от дна стакана. Уровень воды должен достигать верхней части гильзы А. Для равномерного распределения температуры в стакане используют мешалку.

Методика. Испытуемый образец подготавливают в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Заполняют чашку до краев испытуемым образцом. Избыток образца удаляют с обеих сторон шпателем. После того, как гильзы А и Б соединены, проталкивают чашку внутрь на ее место в гильзе Б до упора. Удаляют шпателем образец, выдавленный термометром. Прибор помещают в водяную баню, как описано выше. Водяную баню нагревают до температуры примерно на 10 °C ниже предполагаемой температуры каплепадения и устанавливают скорость нагрева около 1 °C/мин. Отмечают температуру падения первой капли. Проводят не менее трех определений, каждый раз с новым образцом. Разность между показаниями не должна превышать 3 °C. За температуру каплепадения принимают среднее значение трех измерений.

МЕТОД 2 - АВТОМАТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Прибор. Для проведения испытания используют прибор, представленный на рисунке 2.1.2.44.-2, который состоит из сборного картриджа, включающего держатель, в котором свободно фиксируется чашка с испытуемым образцом, и приемника с горизонтальным просветом, который фиксируется под чашкой. Данный картридж вставляют в блок нагревания. Блок представляет собой металлический цилиндр с цилиндрической щелью вдоль его вертикальной оси, внутри которой помещают сборный картридж. Кроме того, имеется другая, более узкая цилиндрическая вертикальная щель, в которую устанавливают температурный датчик на уровне чашки для проб. Снаружи нагревательного блока располагается электрический нагревательный элемент. Под нагревательный блок устанавливают лампу таким образом, чтобы поток света проходил через просвет в приемник на установленный напротив фотодатчик. Блок нагревания с помощью нагревательного элемента способен поддерживать точно установленную температуру, а также нагреваться медленно с постоянной определенной скоростью после начального изотермического периода.

Рисунок 2.1.2.44.-2. - Пример прибора автоматического определения температуры каплепадения. А - держатель чашки; Б - блок нагревания; В - источник света; Г - щель; Д - сборный картридж; Е - нагревательный элемент; Ж - чашка с испытуемым образцом; 3 - фотодатчик; И - приемник; К - температурный датчик

Методика. Испытуемый образец подготавливают согласно указаниям частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству и проводят испытание как указано ниже или в соответствии с инструкциями производителя. Избыток образца удаляют с обеих сторон чашки шпателем. Чашку помещают в держатель и присоединяют рукав. Сборный картридж помещают в блок нагревания. На приборе выставляют первоначальные изотермические условия и скорость постепенного нагревания в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Включают программу температурного режима. Когда первая капля расплавленного образца упадет через щель на дно чашки, тем самым прерывая поток света, сигнал фотодатчика приведет к автоматической регистрации температуры блока нагревания.

Калибровка прибора. Прибор используют в соответствии с инструкциями производителя. В зависимости от использования прибора и испытуемых образцов, регулярно проводят предписанную калибровку и проверку эксплуатационных характеристик системы. Обычно используют сертифицированные стандартные образцы бензойной кислоты и бензофенона. Допускается применение других веществ при условии, что они не проявляют полиморфизм. Калибровку проводят в соответствии с инструкциями производителя или следующим образом. Для каждого из двух сертифицированных стандартных образцов готовят по три чашки и размещают их на чистой поверхности. В каждую чашку помещают небольшое количество сертифицированного стандартного образца и уплотняют стержнем (диаметр около 4,5 мм). Проверяют, чтобы отверстие было полностью заполнено. Наполняют чашку примерно наполовину и уплотняют образцы с помощью стержня (диаметр около 9 мм). Чашку наполняют и уплотняют, при необходимости добавляя образец, пока чашка не будет полностью заполнена.

Температурная программа для бензойной кислоты: начальная температура - 118,0 °C; скорость нагрева - 0,2 °C/мин; конечная температура - 126,0 °C. После установки чашки выдерживают в течение 30 с при температуре 118 °C до начала нагревания.

Температурная программа для бензофенона: начальная температура - 44,0 °C; скорость нагрева - 0,2 °C/мин; конечная температура - 56,0 °C. После установки чашки выдерживают в течение 30 с при температуре 44 °C до начала нагревания.

Проверяют три отдельных результата. Результаты испытания считают достоверными, если полученные значения находятся в пределах +/- 0,3 °C от среднего значения.

Исправленное среднее значение температуры (T2) рассчитывают по формуле:

где: T1 - средняя температура каплепадения по трем измерениям, в градусах Цельсия;

F - поправка на разницу температур образца и места измерения температуры в нагревательном блоке (ее значение изменяется в зависимости от конструкции прибора автоматического определения температуры каплепадения и представляется производителем).

Принимая в расчет температуру каплепадения (T0) сертифицированного стандартного образца, точность температурной шкалы считается удовлетворительной, если |T2 - T0| не превышает 0,3 °C.

2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса

(введен решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 25.10.2022 N 150)

Спектрометрия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) - аналитический метод, позволяющий исследовать химическую структуру органических молекул по интерпретации их спектров ЯМР по магнитным моментам изотопов 1H, 13C, 19F, 15N, 31P. Спектры ЯМР могут быть использованы для качественных и количественных анализов.

В соответствующих экспериментальных условиях интегрированная интенсивность сигналов ЯМР прямо пропорциональна числу спинов ядер молекулярной группы, ответственной за сигнал. Эти интегралы могут использоваться для количественного анализа.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

При помещении группировки ядер с угловым моментом и магнитным моментом в статическое магнитное поле (B0) ядра занимают по отношению к оси магнитного поля определенные ориентации, разрешенные в квантовой механике. Эти уровни энергетически различны. Колебательное высокочастотное магнитное поле (B1), перпендикулярное магнитному полю B0, вызывает переходы между этими уровнями с полным поглощением энергии. Согласно условию резонанса , (где - гиромагнитное отношение, - ларморова частота), магнитное поле B0 или частота поля B1 могут изменяться для получения спектра (метод непрерывной волны (МНВ)). В настоящее время излучение B1 получают при помощи радиочастотного импульса (метод Фурье преобразования). Когерентное излучение, испускаемое при возвращении в исходное состояние, регистрируют в виде затухающей кривой, называемой спадом свободной индукции (ССИ). Последующее Фурье-преобразование дает спектр в области частоты, предоставляя информацию о молекулярной структуре. Дополнительные радиочастотные области применяются во время регистрации сигнала ССИ подавления скалярных взаимодействий (прямая связь) между ядрами (так называемое "распаривание"). Для качественного и количественного анализа жидких или твердых образцов можно применить одно- и многомерные методы.

Важную информацию о структуре вещества получают из следующих спектроскопических параметров, приведенных в таблице 2.1.2.45.-1.

Таблица 2.1.2.45.-1.

Корреляции различных спектральных параметров (например, химический сдвиг и константа спин-спинового взаимодействия, или химические сдвиги различных ядер в пределах одной молекулярной системы) могут быть получены гомо- и гетероядерными двумерными и более многомерными методами. Информацию о времени релаксации T1 и T2, о ядерных эффектах Оверхаузера и кинетике процессов, зависящих от времени, также можно получить с помощью соответствующих экспериментов.

ПРИБОР

ЯМР-спектрометр с высокой разрешающей способностью состоит из следующих частей:

- магнит для создания постоянного магнитного поля;

- термостатируемый датчик с держателем образца, предназначенный для подачи высокочастотного импульса и определения излучения, испускаемого образцом;

- электронное устройство для создания мощных высокочастотных импульсов, регистрации и преобразования сигнала ССИ в цифровую форму; это устройство также поддерживает стабильность электроники прибора;

- устройства сбора и обработки данных (компьютер);

также включает:

- проточную кювету для проведения жидкостной хроматографии ЯМР или проточно-инъекционного анализа;

- систему для создания импульсного градиента магнитного поля ЯМР.

Сильное магнитное поле генерируется катушкой сверхпроводимости в сосуде Дьюара, заполненного жидким гелием. Датчик, как правило, содержит образец в пробирке с внешним диаметром 5 мм или в проточной кювете, и соединен радиочастотными кабелями с электронным блоком, настроенным на частоту 1H-ядер и изотопов X-ядер. Необходимыми являются дополнительные устройства для настройки и регулировки электронных контуров; кроме того, часто используют термостатирование образцов.

Следует подтвердить надлежащее функционирование ЯМР-спектрометра. Для этого используют соответствующие испытания, включающие, как правило, измерение ширины спектральной линии на полувысоте определенных пиков при определенных условиях, отношение сигнал/шум (S/N) для стандартных смесей, интенсивность импульса (измеренная как 90° ширины импульса), и воспроизводимость импульса. Все изготовители приборов предоставляют спецификации и протоколы измерения указанных параметров для определенных комбинаций прибор/датчик, и необходимо проводить проверку соответствия этим спецификациям.

ЯМР С ФУРЬЕ-ПРЕОБРАЗОВАНИЕМ (ЯМР-ФП)

Как правило, в современных спектрометрах используется принцип Фурье-преобразования: после возбуждения образца высокочастотным импульсом соответствующей частоты (v), амплитуды (B1) и продолжительности и последующей короткой паузы (fd) (время восстановления чувствительности приемника), усиленный аналоговый сигнал ССИ регистрируют в течение определенного времени (tac) и переводят в цифровую форму аналогово-цифровым преобразователем (АЦП), результаты сохраняют в памяти спектрометра. Выходной сигнал усиливается перед оцифровкой для максимального повышения чувствительности, не перегружая АЦП. При наблюдении за X-ядрами стандартный эксперимент включает, при необходимости, широкополосное 1H распаривание (возбуждение) всех протонов. Для увеличения отношения сигнал/шум, многократные сигналы ССИ могут быть когерентно накоплены и суммированы. При Фурье-преобразовании данных этого временного интервала получают спектр области частот.

ПАРАМЕТРЫ

Следующие параметры влияют на результат эксперимента Фурье-преобразования, и должны контролироваться.

Ширина импульса . Импульс возбуждения направлен вдоль оси x так называемой рамки вращения, его продолжительность (или "ширина") определяет угол переворота и, таким образом, интенсивность резонансного сигнала:

где: - продолжительность ("ширина") импульса;

- угол поворота рамки вращения;

- гиромагнитное отношение.

где: M - наблюдаемая намагниченность;

Mо - общая намагниченность;

- угол поворота рамки вращения.

Наблюдаемая намагниченность максимальна при . Продолжительность импульса должна быть короткой, чтобы гарантировать, что все сигналы возбуждения в спектральной ширине имеют одинаковую интенсивность. Намагниченность затухает вследствие процессов релаксации.

Длительность паузы (td). Пауза - время между окончанием подачи импульса и началом сбора данных, необходимое по техническим причинам, поскольку ее длительность может влиять на интенсивность сигнала и фазу пика. Быстро затухающие сигналы (дающие начало широким спектральным линиям) уменьшаются в интенсивности больше, чем медленно затухающие сигналы (которые дают начало узким спектральным линиям).

Время сбора данных (tac). Время сбора данных связано со спектральной шириной (то есть всей наблюдаемой областью) и количеством точек цифрового разрешения, собранных во время обнаружения сигнала.

где: SW - спектральная ширина;

DP - количество точек цифрового разрешения.

Максимальная интенсивность сигнала и отношение сигнала к шуму будут достигнуты, если время сбора данных приблизительно равняется , где v1/2 - полная ширина на полувысоте, но для минимизации искажения сигнала эта величина должна быть более .

Время повторения (tr). Спин-решеточная релаксация влияет на время, требуемое для спиновой системы, чтобы прийти в равновесие после импульса. Релаксация может быть уменьшена при помощи специальных реактивов. В количественном анализе используемое время повторения должно устанавливаться относительно спин-решеточной релаксации и угла поворота рамки вращения, во избежание эффектов насыщения.

Усиление приемника. Аналоговый сигнал, детектируемый датчиком, усиливают до оцифровки и хранения. Усиление сигнала должно быть отрегулировано либо автоматически, либо вручную, чтобы сигнал не перегружал АЦП, что может вызывать в свою очередь искажение сигнала, и позволит оцифровывать случайный шум, произведенный при исследовании (то есть быть отличным от нуля).

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ СБОРА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ

Помимо параметров сбора данных, интенсивность сигнала зависит еще от нескольких параметров. После сбора достаточного количества циклов сканирования, сводный сигнал ССИ преобразовывается с помощью Фурье-преобразования. Для достоверного количественного определения должны быть оптимизированы следующие параметры.

Цифровое разрешение. Цифровое разрешение - частотное разделение между измеренными точками. Обработанный сигнал должен иметь не менее 5 измеренных точек выше полувысоты интегрируемых сигналов. Для улучшения цифрового разрешения перед преобразованием к концу экспериментальной ССИ могут быть прибавлены дополнительные точки нулевой интенсивности ("нулевое заполнение").

Отношение сигнал/шум. Это отношение между интенсивностью (высотой пика) определенного сигнала в ЯМР-спектре и случайных колебаний, которые обычно измеряются в области спектра, который не содержит сигналов от анализируемого вещества. Низкое значение отношения сигнал/шум ограничивает точность интегрирования пика и количественных определений. При отношении сигнал/шум равным или более 150:1 стандартное относительное отклонение при интегрировании пика может быть менее 1%. В программном обеспечении современных спектрометров имеются алгоритмы по определению отношения сигнал/шум соответствующих пиков. При анализе разбавленных растворов получить достаточно высокое отношение сигнал/шум довольно трудно, особенно при детектировании ядер, отличных от 1H. Способы увеличения отношения сигнал/шум включают в себя:

- увеличение количества суммируемых измерений (n), поскольку отношение сигнал/шум увеличивается с увеличением ;

- использование экспоненциального умножения сигнала ССИ перед Фурье-преобразованием: экспоненциальный коэффициент умножения должен быть в зоне полной пиковой ширины на полувысоте;

- использование спектрометров с более высоким постоянным магнитным полем (B0), так как отношение сигнал/шум пропорционально ;

- использование цифрового фильтра для уменьшения шума;

- использование датчиков, которые максимизируют фактор заполнения;

- использование криодатчиков, снижающих тепловые помехи.

Область интегрирования. Интенсивность ЯМР-сигналов получают интегрированием квази-аналогового сигнала или с помощью ступенчатого графика, или более точным интегрированием отдельных линий и цифровым представлением данных. При исследовании жидких образцов получают ЯМР-сигналы в виде линий лоренцевой формы. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству или когда происходит перекрывание пика, для испытуемого пика и пика сравнения должен использоваться одинаковый диапазон интегрирования, выраженный в виде кратного числа полной ширине на полувысоте пика.

Динамический диапазон. Динамический диапазон аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) определяет минимальную линию интенсивности, которую можно наблюдать или количественно определить, при интегрировании двух сигналов с той же самой шириной спектральной линии. 16-битовый АЦП позволяет идентифицировать сигнал интенсивностью 0,003% относительно сильного сигнала, полностью заполняющего динамический диапазон АЦП.

ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ ОБРАЗЦОВ В РАСТВОРАХ

Большинство ЯМР исследований проводят на разбавленных растворах (приблизительно 1%) испытуемого образца в соответствующем растворителе, к которому может быть прибавлен в известной концентрации подходящий стандарт для калибровки химического сдвига.

Растворители. Растворитель должен растворять испытуемый образец без дальнейшего взаимодействия, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. Для минимизации интенсивных сигналов растворителей используют полностью дейтерированные растворители (дейтерия оксид P, дейтерированный хлороформ P, дейтерированный диметилсульфоксид P, дейтерированный ацетон P, дейтерированный метанол P и т.д.). Атомы растворителя дают сигналы, которые легко идентифицируются по их химическому сдвигу, и могут использоваться для калибровки оси химического сдвига (вторичный стандарт).

Сравнение. Спектральная характеристика, наиболее зависящая от химического окружения атома в молекуле, называется химическим сдвигом, обозначается буквой и измеряется в миллионных долях (ppm). Химический сдвиг резонансной частоты для ЯМР активного ядра X измеряется в миллионных долях (ppm), как разность между резонансной частотой этого ядра и резонансной частотой внутреннего стандарта сдвига, выраженная в герцах, деленная на основную рабочую частоту спектрометра, в мегагерцах, при данном постоянном магнитном поле:

где: - химический сдвиг резонансной частоты для ЯМР активного ядра X, в ppm;

vX,образец - резонансная частота активного ядра X, в герцах;

vX,сравнение - резонансная частота внутреннего стандарта сдвига, в герцах;

vприбор - основная рабочая частота спектрометра, в мегагерцах.

Условно принято, что точный химический сдвиг устанавливается по 1H резонансной частоте тетраметилсилана P (ТМС), и обозначается как . Установив шкалу сдвигов 1H относительно ТМС можно вычислить точную частоту любого другого X резонанса, и откалибровать масштаб его химического сдвига. Частоту (вторичного) стандартного образца при рассчитывают по 1H частоте ТМС и табличному значению отношения частоты, определенной для изотопа, к частоте 1H в ТМС:

где: vX,сравнение - частота (вторичного) стандартного образца при ;

VH,ТМС - 1H частота тетраметилсилана;

SX,сравнение - табличное значение отношения частоты, определенной для изотопа, к частоте 1H в тетраметилсилане.

Стандартные образцы при и соответствующие значения приведены в таблице 2.1.2.45.-2.

Таблица 2.1.2.45.-2.

--------------------------------

<1> Химический сдвиг зависит от значения pH.

<2> DSS - натрия 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат.

На практике химические сдвиги X сравнивают, непосредственно используя соответствующий стандарт. В 1H и 13C ЯМР главным образом используется внутренний стандарт, который при исследовании непосредственно прибавляют к испытуемому образцу. В 15N, 19F и 31P ЯМР часто используется внешний стандарт, когда образец и стандарт находятся в отдельных коаксиальных цилиндрических пробирках.